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什么?你居然直接跑RACE?直接GenomeWalking?

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发表于 2016.8.22 21:09:03 | 显示全部楼层 |阅读模式
    首先,标题一定要引人注目。    经常在各大Q群,各大论坛上看到诸如以下问题:
    测了转录组,组装出来的Unigenes 缺胳膊短腿,直接没有全长CDS?5端 不全?3端不全?老板让必须克全长怎么办?要做转基因啦,没有CDS全长咋整?实验技术高超的朋友,比如我,直接就上race,分分钟拿到全长CDS,然并卵,条条大路你不走,偏偏要去穿树林?浪费时间不要紧,经费能搞几个试剂盒?我这一剂,帮你省钱,别客气。
    1. 打开 TBtools,亦即传说中的 淘宝工具,可以看到随机出现的名人名言,先学习一下


     2. 选择‘Blast’->选择‘eGenomeWalking’


      3.1 如果之前没有建立数据库,那么点击‘new fastq db’直接从fastq文件开始建数据库,建好的数据库以后都能用


      3.2 如果已经有建立好的数据库,或者数据库初始化完毕,那么设置数据库文件,点击‘initialize’,进行初始化。初始化成功,则可以选择相应的数据库。


    4. 黏贴用于延伸3端的序列,如果要延伸5端,请使用Sequences Toolkits下面的Sequences manipulator反向互补,随后点击开始



      5. 等待运行,随后会弹出选择框,其中第一行对应的是hookSeq 也就是用于抓取的原始序列,第二行及其后对应的是所有比对上的reads,人工选择自己信任的区域,或者区域对应的终点(注意,如果选择区域的终点列比hookSeq结束列前,那么会缩短序列,如果选择的区域和hookSeq有重叠,那么如果选择区域中对应位点最大频次的碱基与hookSeq不同,那么会矫正hookSeq,这个是高级功能,基本不用),点击continue, 则增加的序列或者调整后的序列会替换点原始输入序列,在本例中,是延伸3端




      6. 重复这个步骤,直到人工判定不能再延伸或者是不需要延伸即可。如果是要检验结果,则点击Check By Pileup Grapher,则会出现对应的reads覆盖当前序列的图,也可以直接自己到NCBI或者其他工具做序列完整性和可靠性检验


      *. 相同的原理,用于转录组测序数据,那么是做e-Race,用于重测序或者基因组测序数据,那么是做e-Tail或者e-GenomeWalking

      *. 有朋友提问,对于重复序列怎么办?这个只能靠用户,用户决定什么时候延伸,延伸多少。


搞定... 下地,打扫实验室卫生,写这个教程足足跨越了6个小时。

洗澡,看剧,拜拜



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帝王蝶

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发表于 2016.8.22 21:21:09 | 显示全部楼层
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迅猛龙

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发表于 2016.8.22 21:48:28 | 显示全部楼层
貌似很厉害!~先收藏了!
新的一天加油!
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发表于 2016.8.23 08:54:09 | 显示全部楼层

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帝王蝶

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发表于 2016.8.23 08:55:29 | 显示全部楼层
请问大神数据库怎么建,是用测序的所有f拼接序列的asta文件吗?望指点
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 楼主| 发表于 2016.8.23 12:06:03 | 显示全部楼层
zuo 发表于 2016.8.23 08:55
请问大神数据库怎么建,是用测序的所有f拼接序列的asta文件吗?望指点

用测序数据,直接建库
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迅猛龙

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发表于 2016.8.23 12:39:22 | 显示全部楼层
签到
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发表于 2016.8.23 22:59:01 | 显示全部楼层
真棒,
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钵水母

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发表于 2016.8.24 09:41:25 | 显示全部楼层
人才!big wet!
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帝王蝶

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发表于 2016.8.24 09:59:56 | 显示全部楼层
谢谢大神指点,我最近有要扩基因全长,这个方法可以省去做race吗?我还是不太懂,请问是用测序下机数据的clean reads建库吗?本人小白,您能说一下具体的操作步骤吗?谢谢!!!!!
加油
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帝王蝶

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发表于 2016.8.24 11:38:55 | 显示全部楼层
看着好像很牛的样子。我有个问题,既然denovo组装都没组装出完整的CDS,用reads怎么就能延伸出5’或3’端了呢?
新的一天加油!
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 楼主| 发表于 2016.8.24 17:10:20 | 显示全部楼层
zuo 发表于 2016.8.24 09:59
谢谢大神指点,我最近有要扩基因全长,这个方法可以省去做race吗?我还是不太懂,请问是用测序下机数据的cl ...

对的,就用测序下机数据即可。
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 楼主| 发表于 2016.8.24 17:11:37 | 显示全部楼层
vikinaruto86110 发表于 2016.8.24 11:38
看着好像很牛的样子。我有个问题,既然denovo组装都没组装出完整的CDS,用reads怎么就能延伸出5’或3’端了 ...

测到多少能延伸多少,弥补组装软件的缺陷。
如果真的数据就米有测到,那么就延伸不了。
充分利用数据而已
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发表于 2016.8.25 15:51:25 | 显示全部楼层
膜拜
我要看看,我到底有多么的喜欢你!
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帝王蝶

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发表于 2016.8.29 14:52:50 | 显示全部楼层
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钵水母

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钵水母

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发表于 2016.9.12 20:19:26 | 显示全部楼层
本帖最后由 crescent010 于 2016.9.12 20:24 编辑

楼主我的数据建库那总有问题,想问选原因。按你的说明3.1的结果和3.2点击‘initialize’后不能选择curren DB

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 楼主| 发表于 2016.9.13 21:34:22 | 显示全部楼层
crescent010 发表于 2016.9.12 20:19
楼主我的数据建库那总有问题,想问选原因。按你的说明3.1的结果和3.2点击‘initialize’后不能选择curren D ...

先从 New FastQ DB 建库,如果正常建成,那么会自动有附加路径上去,如果没有,那么就是建库失败或者其他原因,具体可加TBtools使用交流群
TBtools使用交流群 553679029
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 楼主| 发表于 2016.9.13 21:35:15 | 显示全部楼层
crescent010 发表于 2016.9.12 20:19
楼主我的数据建库那总有问题,想问选原因。按你的说明3.1的结果和3.2点击‘initialize’后不能选择curren D ...

你的情况应该是 还没有安装Blast程序或者是 Blast没在环境变量中,
请先百度搜索  windows下安装Blast+
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