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[动植物重测序] 简化基因组各种方法介绍与比较

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  • TA的每日心情

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    发表于 2016.7.27 09:58:57 | 显示全部楼层 |阅读模式
    简化基因组技术有很多种方法,有RAD,GBS,2b-RAD,dd-RAD,SLAF等,这些不同的简化基因组方法到底有什么区别?各自又适用于哪些情况?看完这篇文章,以后不再迷糊啦~

    什么是简化基因组?

    简化基因组技术是指利用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切,并对酶切片段进行高通量测序的技术。简化基因组技术由于只对酶切片段进行测序,因此大大降低了基因组的复杂度,并且不受参考基因组的限制,无参考基因组的物种也可以使用该技术进行分子标记鉴定与开发,因此广泛应用于分子标记开发、群体遗传分析、遗传图谱构建、QTL定位、全基因组关联分析等群体研究与分子育种领域。

    简化基因组各种方法介绍与比较

    其实那么多种简化基因组方法的区别就在于单酶切还是双酶切、是否有随机打断、使用不同的内切酶、是否加barcode、接头设计等这些细节,本质还是一样的,就是对基因组进行酶切并对酶切片段进行测序。在这些方法中,RAD和GBS是使用最广泛的两种方法,2b-RAD,dd-RAD,SLAF等都是在这些方法的基础上在不同细节处改良。

    RAD(Restriction site Associated DNA):是与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA。RAD seq技术于2008年由Baird提出[1]。RAD方法对基因组DNA进行单酶切,然后对酶切片段超声波随机打断,因此测序得到的read1是位置对齐的,而read2是参差不齐的,因此可用于denovo聚类拼接,获得较长的contig,有利于开发SSR等分子标记。

    GBS(Genotyping-By-Sequencing):是指通过测序进行基因分型。2011年由Elshire, R. J.提出[2]。GBS方法对基因组DNA进行单酶切,不需要超声波随机打断,而是利用PCR进行片段大小选择;并且对不同的样品加上不同的barcode,可对多达96个样品进行pooling建库,简化了建库步骤,因此比RAD成本更低。现在的GBS经过改良,普遍使用双酶切了,双酶切能够得到在基因组上分布更均一的酶切片段。双酶切的GBS,有时候又被称为dd-RAD(下文介绍)。

    dd-RAD(double-digest RAD,也可以称为dd-GBS):是双酶切的RAD,并且通过切胶来进行片段选择,2012年由Brant K.提出[3]。其实dd-RAD已经放弃了经典RAD的超声波片段化的策略,dd-RAD的建库流程和经典的GBS更为相似,所以下文我们也将之称为dd-GBS。 dd-RAD最大的优势在于,由于使用了两种内切酶处理,最终获得片段在基因组上的分布更加均一,从而提高了数据的有效性。由于目前的GBS方法普遍使用双酶切,并且用电泳切胶来取代PCR扩增来选择片段大小,因此dd-RAD几乎等同于目前的GBS方法了。

    2b-RAD(IIB-RAD):采用IIB型限制性内切酶进行酶切,由王师教授2012年提出[4]。IIB型限制性内切酶在酶切识别位点的上游和下游分别切断基因组DNA,获得固定长度的片段。片段比较短,只有33-36bp。

    SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing):是由百迈克公司在2013年提出的一种简化基因组方法,采用双酶切和双barcode接头,整个建库原理和效果与dd-GBS类似[5]。

    下面是几种方法的建库流程图:









    几种简化基因组方法的比较如下表:


    *评估根据:RAD:六碱基或八碱基酶评估;GBS:Elshire et al[2]的数据;dd-RAD:Peterson et al[3]中Table1数据;2b-RAD:5-7个特异性碱基的IIB型限制性内切酶评估;SLAF:Sun X et al[5]的数据。

    简化基因组的应用

    简化基因组技术由于降低了基因组的复杂度、比全基因组重测序成本低,因此广泛应用于遗传图谱构建与QTL定位、群体进化分析、群体遗传分析、全基因组关联分析等研究领域。那么,这么多种方法,应该如何选择呢?概括来说可以从以下几方面考虑:

    1.所需标记数
    不同的研究目的,所需的标记数量并不完全一样。通常,需要在全基因组范围内进行功能区间扫描和功能基因挖掘的研究,如全基因组关联分析和选择压力分析,就需要上万个高密度的分子标记,而系统发育关系、地理群体结构、基因流、系谱检测、连锁分析等研究的分子标记密度则不需要那么高,一般只需要几百到几千个分子标记足以完成分析。

    对于基因定位的研究,不同的研究材料、作图群体,也会影响到需要的标记数目。例如利用自然群体进行全基因组关联分析,所需的标记数与物种的LD衰减距离相关,物种LD衰减得越快,所需的标记数就越多。又例如利用作图群体进行连锁作图QTL定位,所需的标记数与作图群体类型和群体大小有关。群体经历的世代越多(如RIL群体),群体越大,则重组事件越多,理论上提高标记密度可以有效提高遗传图谱的质量,所以所需的标记数越多。

    因此,可先评估研究所需的标记数,再选择适合的简化基因组技术。RAD技术因为对所有酶切位点都检测,因此标记数要比GBS多,适合于需要标记密度高的研究,如选择压力分析。dd-GBS类的技术虽然收集的片段偏少,但标记分布更加均一,所以数据有效性更高;并且建库成本比RAD低,更适合大样品量的研究。

    2.有无参考基因组

    如果所研究物种没有参考基因组,那么RAD技术更合适,因为RAD技术可以利用不对齐的read2进行denovo拼接,再与read1拼接,可以得到长达400~500bp的片段,有利于SSR分子标记开发以及后续的引物设计。而2b-RAD由于片段过短,容易受重复序列干扰,且后期不利于设计引物验证测序得到的SNP。因此,2b-RAD不建议用在没有参考基因组的物种,和大的复杂的基因组上。

    3.研究经费

    简化基因组测序与全基因组重测序相比,由于只对酶切片段进行测序,因此在测序费用上大大下降。而由于目前的各种简化基因组技术都会使用barcode对多个样品进行混合建库,因此各方法间的建库成本差异已经不大。但RAD文库构建过程中有超声波打断步骤、dd-RAD需要使用Pippin Prep等仪器,因此成本还是要比GBS等高。在实际情况中,可根据具体样品数和研究经费选择合适的技术方法。

    4.主流技术

    如上面提到,RAD和GBS技术是使用最广泛的两种简化基因组技术,其他的技术方法都是在这两者的基础上的改进或细化。下图是统计截止到2016年7月份的几种简化基因组方法的发表文章数与文章引用率(数据来源于Pubmed):



    最后再强调一次,这几种技术背后的原理大同小异,没有本质区别。由于RAD和GBS技术出现较早,而且目前依然比较主流,因此其无论是发文数量、还是方法学文章引用率都远远领先于其他方法。目前,基迪奥主要提供两种简化基因组的测序策略,分别是经典RAD和dd-GBS,已经足以满足绝大部分简化基因组研究的需求。

    参考文献:
    [1] Baird NA, Etter PD, Atwood TS, Currey MC, Shiver AL, et al. (2008) Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers. PLoS One 3: e3376. doi: 10.1371/ journal.pone.0003376.
    [2] Elshire, R. J.et al. A robust, simple Genotyping by-Sequencing (GBS) approach for high diversity species. PLoS ONE 6, e19379 (2011).
    [3] Peterson, B. K., Weber, J. N., Kay, E. H., Fisher, H. S. & Hoekstra, H. E. Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species. PLoS ONE 7,e37135 (2012).
    [4] Wang, S., Meyer, E., McKay, J. K. & Matz, M. V. 2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping. Nat. Methods 9, 808–812 (2012).
    [5] Sun X, Liu D, Zhang X, et al. SLAF-seq: an efficient method of large-scale de novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e58700.
    [6] Andrews K R, Good J M, Miller M R, et al. Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics.[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.

    小师妹已经总结得很全面啦,如果你看完还有问题,可以留言给我们,我们人员有空会回复你哒~


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    非常不错
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