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[smallRNA] 小RNA分析讨论

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钵水母

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发表于 2016.1.4 22:28:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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hello,大家好!很高兴加入这个论坛,有几个问题想请教一下,
1. 小RNA测序数据经过预测后得到大量的miRNA,每个miRNA都有多个预测得到的前体,怎么确定哪个才是正确的前体呢?特别是自由能,自由能系数都相似的情况下?  

2。小RNA测序后的数据都要经过去街头,过滤低质量数据等一系列的处理,我看到很多文章都说要去掉其他的非编码RNA,那这个去除非编码RNA的操作是必须的吗?具体该怎么操作呢?文献里只是提到用到的软件什么的,具体作法并没有提,

3。miRNA有一定的碱基偏好性,那碱基偏好性的图应该怎么做呢?需要做些什么呢?用什么软件或是方法比较好呢?

希望有高手来帮我解惑!非常感谢!!!!!!

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钵水母

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发表于 2016.1.5 13:36:19 | 显示全部楼层
第一个问题,可以用丰度信息来辅助,高丰度的可信度更高,
第二个问题,最后还是去除,去除方法最简单就是比对,测序得到的tag比对上其他非编码的RNA,则直接去掉
第三个问题,统计处每个碱基的AGCT的比例后,直接excel就能作图

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帝王蝶

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发表于 2016.1.5 17:33:48 | 显示全部楼层
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帝王蝶

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发表于 2016.1.5 23:12:19 | 显示全部楼层
1.miRNA对应的前体一般不会很多,不知道你是如何预测的前体。是否方法有改进空间。另外,楼上方法值得注意。表达丰度低的,可靠度不高。
2.方法见楼上,主要还是比对数据库(常用的是nr,pfam等),去除其他非编码RNA的目的,一方面是检测其他类型RNA的含量,比如有人关注siRNA的含量;另一方面,也为了后面可以预测 known miRNA和 novel miRNA排除一些干扰。
3.这个需要用一些编程的手段,来进行各位置的碱基统计,之后作图方法就多了,比如excel,R,SVG。

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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.1.6 11:31:47 | 显示全部楼层
我的前体是通过软件预测得到的,表达丰度不是指mirna的吗,我是挑选的表达丰度高的,可是有的MIRNA的TPM都在1000以上了依然有多个前体,并且序列和自由能也类似,我无法判断哪一个才是正确的;
第二个 问题用rfam可以吗,好多文献里都用这个,只用这一个行吗,我看到文献里都是好几个的
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钵水母

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发表于 2016.1.7 23:49:03 | 显示全部楼层
可以看看形成的前体,那些既有5p的tag,又有3p的tag,更可信
用Rfam可以,没有什么问题
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.1.11 15:03:35 | 显示全部楼层
非常感谢各位的热心解答
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发表于 2016.1.13 14:36:39 | 显示全部楼层
你的物种是什么,是有参考基因组的物种还是无参考基因组的物种。
首先,你需要明白一个问题:miRNA存在基因家族,1个miRNA完全有可能来自不同的前体。所以在序列匹配度完全相同的情况下,纠结于哪个正确其实没有必要,很可能几个都是正确的。需要实验验证来确定。
新的一天加油!
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.1.18 15:00:09 | 显示全部楼层
有有基因组的,有没有基因组的,如果通过自由能,匹配度之类的完全符合标准,说明都是正确的话,用什么实验方法来验证呢?
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钵水母

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发表于 2016.1.20 10:00:59 | 显示全部楼层
你可以将前体进行异源表达,然后再检测是否有目的miRNA的形成(定量PCR就可以)。这个方法需要注意两点:
1.异源表达的前体在构建载体的时候转入的片段要大于前体的长度,也就是前体的前后各延长100bp左右,保证前体可以形成miRNA
2.异源表达的物种本身不能形成目标miRNA。
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.1.20 16:45:07 | 显示全部楼层
第一点我明白,就是直接过表达pre-miRNA,最后检测是怎么检测呢?直接RT-PCR是什么意思?还有第二点异源表达的物种本身不能形成目标miRNA是指目标miRNA在异源表达的物种中尚未被公布或是不存在的意思吗?构载体最常用的植物是拟南芥或水稻,它们是研究MIRNA最充分的,这个条件很难满足啊????????
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发表于 2016.1.22 09:07:46 | 显示全部楼层
基迪奥--刘倩 发表于 2016.1.20 10:00
你可以将前体进行异源表达,然后再检测是否有目的miRNA的形成(定量PCR就可以)。这个方法需要注意两点:
1 ...

我有个问题:我做的无参物种的miRNA,也就是说我的数据没有miRNA前体数据,只有成熟体序列。想做表达验证,有什么好办法吗?构建人工miRNA表达载体,用于验证我的物种miRNA(know,novel两种)功能,可以吗?
你好
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钵水母

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发表于 2016.1.26 10:01:35 | 显示全部楼层
山水之间 发表于 2016.1.20 16:45
第一点我明白,就是直接过表达pre-miRNA,最后检测是怎么检测呢?直接RT-PCR是什么意思?还有第二点异源表 ...

是指不存在或者丰度很低。检测pre-miRNA用Qpcr。
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草履虫

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发表于 2016.3.24 20:27:09 | 显示全部楼层
顶一个吧!
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发表于 2016.4.7 17:49:14 | 显示全部楼层
请问,我测序获得novel miRNA表达量很低,QRT-PCR检测,模板量已经很大了,但CT总是很大,都33以上,有点甚至36。但溶解曲线单峰清楚,而且电泳检测大小也对。我做的颈环法RT,请问低丰度miRNA怎么检测和验证??谢谢
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帝王蝶

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发表于 2016.4.8 22:26:38 | 显示全部楼层
无参的small RNA测序(有转录组)。能得到miRNA的前体吗?
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帝王蝶

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发表于 2016.4.10 10:17:40 | 显示全部楼层
学习了
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钵水母

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发表于 2016.4.11 21:32:28 | 显示全部楼层
学习了。。
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发表于 2016.4.13 17:45:09 | 显示全部楼层
hyq 发表于 2016.4.8 22:26
无参的small RNA测序(有转录组)。能得到miRNA的前体吗?

可以比对转录组,有一定概率可以测到前体。但前体是否可以测到看人品啊。前体可能被降解了,或没有polyA尾巴,建库的时候没有被富集到。
新的一天加油!
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发表于 2016.4.13 17:46:48 | 显示全部楼层
real 发表于 2016.4.7 17:49
请问,我测序获得novel miRNA表达量很低,QRT-PCR检测,模板量已经很大了,但CT总是很大,都33以上,有点甚 ...

实验技术,我没有特别好的建议。 但是,miRNA的作用是依赖于其表达丰度的。对于极低表达量的miRNA,其调控能力是很弱的,不会有明显的生物学意义。
新的一天加油!
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