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iTRAQ蛋白定量实验流程介绍

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帝王蝶

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发表于 2015.12.30 13:14:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
越来越多的我关注蛋白水平的变化,方法也有不同,但是大体思路是一样的,下面介绍下iTRAQ蛋白定量原理,供大家理解。
1.蛋白提取步骤
1)剪取适量样品转移至1.5ml离心管,用剪刀剪成细小碎片;
2)加入适量裂解液,终浓度为1mM的PMSF、2mM 的 EDTA,5min 后加入终浓度为10mM的DTT;冰浴超声5min,  25000g*4℃离心20min,取上清;
3)向上清液中加入5 倍体积的冷丙酮溶液、终浓度为 10mM 的DTT,-20℃沉淀过夜;25000g*4℃离心20min,除上清;
4)向沉淀加入1.5ml冷丙酮、终浓度 10mM的 DTT,-20℃沉淀 30min,25000g*4℃离心20min 除上清;

5)重复步骤4一次;
2、蛋白定量---考马斯亮蓝法,如下:

3、蛋白SDS-PAGE电泳
分离胶的浓度:12%SDS聚丙烯酰胺凝胶

原理:SDS为阴离子表面活性剂,打断蛋白氢键和疏水键,与蛋白形成复合物带强负电荷,掩盖蛋白原来的电荷差异。蛋白迁移率不受电荷和分析性状影响,只按照分子大小迁移。
4、酶解
每个样品精确取出100μg蛋白。
按蛋白:酶=20:1的比例加入Trypsin(胰蛋白酶) 37℃酶解4h
按上述比例再补加Trypsin一次,37℃继续酶解8h




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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2015.12.30 13:16:08 | 显示全部楼层
5、iTRAQ 标记
•酶解结束后,将肽段冷冻抽干,再用0.5M的TEAB复溶;
•将iTRAQ标签试剂取出,用异丙醇活化后,对应地加入到相应的样品中;
•在室温条件下精置孵育2h。
•标记完毕后将同个group内的多个样品混合成一管,冷冻抽干。D:\AnZhuanPan\Temp\5\标记
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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2015.12.30 13:24:08 | 显示全部楼层
6、液相分离
采用岛津LC-20AB液相系统(或者其他系统)进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段复溶并进行梯度洗脱。经过筛选得到10个组分。每个组分分别用Strata X除盐柱除盐,然后冷冻抽干。
7、液相串联质谱分析
将抽干的每个组分采用试剂除去不溶物质。每个组分通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪或者其他液相质谱仪进行分离。
经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪:经过一级质谱的筛选后。用碰撞能量对肽段进行筛选,二级碎片在Orbi中检测,分辨率为17500。每个峰强度超过20000的一级母离子打15个二级谱图,一级扫描和二级扫描交替进行。最终进行二级扫描鉴定。
8.下机数据
下机数据为raw后缀文件,用Proteome Discoverer (ver. 1.3.0.339; ThermoFisher Scientific, San Jose, CA)软件整合并转化成mgf后缀文件,再用Mascot或其他软件进行肽段和蛋白的鉴定和定量。

好啦,实验部分就这么多啦,接下来就是生物信息分析了啊。。。

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钵水母

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发表于 2016.1.5 11:08:44 | 显示全部楼层
实验过程好简洁。
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发表于 2016.1.5 14:23:22 | 显示全部楼层
楼猪 不错啊,不过真实实验应该更复杂吧。不同类型的样本提取方法可能不一样。
我外在的一本正经掩饰不住内心的闷骚!
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发表于 2016.1.6 17:06:39 | 显示全部楼层
看似简单其实最后的数据分析还是比较复杂的,不过数据很不错,比起我们双向来做就好了很多
不用回家了
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钵水母

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发表于 2016.1.7 18:18:28 | 显示全部楼层
不懂的过来学习一下
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钵水母

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发表于 2016.1.7 20:06:20 | 显示全部楼层
学习一下~很棒很棒,32个赞!!!
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发表于 2016.1.9 11:50:36 | 显示全部楼层
喜欢的很
不用回家了
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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2016.1.10 12:45:22 | 显示全部楼层
阿福 发表于 2016.1.5 14:23
楼猪 不错啊,不过真实实验应该更复杂吧。不同类型的样本提取方法可能不一样。 ...

真实的实验操作肯定比较复杂啦,此处说的是原理和大致步骤,呵呵
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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2016.1.10 12:46:06 | 显示全部楼层
496071151 发表于 2016.1.6 17:06
看似简单其实最后的数据分析还是比较复杂的,不过数据很不错,比起我们双向来做就好了很多 ...

技术不断更新,蛋白定量技术也会越来越成熟的。。。
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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2016.1.10 12:46:27 | 显示全部楼层
xujianbo 发表于 2016.1.7 20:06
学习一下~很棒很棒,32个赞!!!

有所帮助就好!
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帝王蝶

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发表于 2016.1.11 14:17:34 | 显示全部楼层
跑来学习一下 好清晰的整理啊!
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钵水母

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发表于 2016.2.26 14:25:41 | 显示全部楼层
为什么Bradford定量时误差很大?都是10微克蛋白明显结果矛盾的不要不要的?蛋白浓度测得分别是1,2是4微克/微升;3,4是2.5微克/微升;5,6是2.3微克/微升;7,8是2.8微克/微升。看帖子写的是Bradford的范围是0-1微克/微升,是不是超过这个范围就不准了?图上3的所以条带明显比1的都淡,应该是有的淡有的浅啊。

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帝王蝶

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 楼主| 发表于 2016.3.2 17:49:29 | 显示全部楼层
天上空 发表于 2016.2.26 14:25
为什么Bradford定量时误差很大?都是10微克蛋白明显结果矛盾的不要不要的?蛋白浓度测得分别是1,2是4微克/ ...

任何技术都有一个量程范围,所以蛋白太高或者太低,误差都会偏大
图中3上样量比较少,所以其中蛋白的含量可能比1少啊,所以正常的出现你这种结果,
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钵水母

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发表于 2016.5.31 08:34:22 | 显示全部楼层
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中华鲟

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发表于 2019.12.7 07:56:03 | 显示全部楼层
太棒了,感谢楼主分享
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帝王蝶

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发表于 2020.2.1 21:41:37 | 显示全部楼层
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中华鲟

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灌水之王


发表于 2020.4.24 09:55:42 | 显示全部楼层
学习了
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中华鲟

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灌水之王


发表于 2020.5.18 08:52:43 | 显示全部楼层
实用,先收藏
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