第4期在线交流“无参转录组注释与数据库选择”回顾

小瑶

第4期在线交流“无参转录组注释与数据库选择”回顾

2015年9月15日，基迪奥在信息交流群（QQ群：67185986）举办了无参转录组注释与数据库选择，交流的问答整理如下：

第4期在线交流PPT在此下载~

问1：拼接过程中参数怎么选择，一般都是按默认的吗？

答：目前转录组拼接大多使用trinity软件，拼接的参数一般采用默认的。软件在设置参数时已经经过了多次验证，这个参数是可靠的。具体可以参考这篇文献：

Henschel R, Lieber M, Wu L, Nista, PM, Haas BJ, LeDuc R.Trinity RNA-Seq assembler performance optimization. XSEDE 2012 Proceedings ofthe 1st Conference of the Extreme Science and Engineering DiscoveryEnvironment: Bridging from the eXtreme to the campus and beyond. ISBN: 978-1-4503-1602-6 doi>10.1145/2335755.2335842.

问2：Unigene对基因组测序有哪些意义？

答：转录组Unigene对基因组有优化基因的作用，可以优化基因结构，使得基因组上的基因更加完善。

问3：Unigene能代表基因组就有这么多基因吗？

答：不能。基因组上的基因并不是全部表达的，基因组上的基因只有部分维持基本生命活动的基因稳定表达，其他基因的表达是具有时空特异性的，即只是在特定组织或者生长状态表达。而转录组测序结果只是检测到特定取样时期表达的基因，所以不能代表基因组的全部基因。

问4：打开和编辑unigene序列的软件哪个最好用？感觉bioediter不太好用啊。

答：unigene序列的软件可以采用VIM, Edit Plus，这两个软件都可以。

问5：预测的多个CDS在unigene的不同区段，就是一个unigene预测多个CDS，怎么解释呢？

答：目前，我们还没有遇到过这种情况，如果你遇到这样的问题，可以将序列发给我们看一下。猜测可能是这样的，CDS可能存在一个可变剪切，比对同源蛋白的时候，可能出现跳读了。所以反链翻译的时候就把他跳过去了。

问6：我看有些文章里面只注释CDS，合理否？

答：没有合理不合理，看需求。

问7：将预测的lncRNA比对到已知数据库，应该怎么筛选？好多都是E-value为0。

答：按照Score来排序找最好的。

问8：怎样的筛选标准比较靠谱呢？

答：一般是采用E值，也会参考score。

问9：E值选多少合理？-10？-5？

答：E值-5

问10：之前有审稿人说我E值太高，我用的-5，他让我至少-10，这怎么解释？

答：可以提供些文献支持，目前文章中大多数为这个标准。

问11：score值最高但是序列不一样长这个能作为已知lncRNA吗？

答：一般不能。除非是全局比对已知的lncRNA且允许几个错配能匹配成功的才认为是已知的lncRNA。

问12：如果比对到很多物种都符合e-value，选得分高得吗？

答：选择score 最高的。我们应该理解，目前基因注释是机器注释，的确是有很多不合理的地方。blast本质上是局部比对，理论上如果两个基因的结构域相同，最后都有可能被注释出来，但这种注释存在一种潜在风险。这两个基因虽然有某个相同的结构域，但蛋白的功能是由多个结构域决定的。如果两个基因只是因为一个结构域相同就判定是同源的，其实这个是有潜在风险的。可能这两个蛋白根本就不是一类东西，因为其他结构域可能是不一样的，最后形成不同功能，最后因为注释结果就判定它是同源的。所以目前因为是机器注释的，没有更好的方法，所以大家看到基于这种的注释结果，也要看下打分。

比如：理论上基因的长度是1K，最后最高的score也才二三百的话，就要小心了，这就意味着1K里面大概就只有200-300bp比对上，score太低了，其实是很大值得去商榷的信息；当基因是1K，score也有八九百，那应该是相当可靠的。

小瑶

问13：我做了3个组织，为方便做差异，3个组织测序结果要合并起来组装，这个文件就会很大，注释的时候要全部注释吗？

答：3个组织的数据会混合组装，得到一套参考序列，组装得到的unigene会全部用来注释。

问14：不同的库注释结果不同怎么办？

答：这个按照我们目前的流程结果来看的话，有个排列的优先级。NR->GO->KO->SwissProt->PFAM->KOG->NT。

问15：非模式动物的GO注释一般用哪个呢？DAVID吗？

答：物种的基因注释的数据库有：NR、SWISSPROT、COG、KEGG，GO的分析是根据NR的基因ID对应过去的，DAVID是做富集分析的。非模式动物的GO注释用blast2go。

问16：可以推荐一个免费的Go注释工具吗？

答：agriGO或Nt都可以。如果是模式物种也可用david，如果不是模式种就用blast2GO。

问17：arigo能基于nr注释生成Go注释吗？

答：agrigo是做富集分析的，不能做注释。

问18：agriGO网站得到的数据可靠吗？感觉结果不够细，发文章可以用吗？

答：数据是可靠的，已经被多次引用。也可直接咨询软件作者，中农苏震老师实验室做的。

问19：swissprot和NR的区别是什么呢？

答：NR，SwissProt是两个著名的蛋白数据库，其中SwissProt是经过严格筛选去冗余的，NR库是最全的但信息会有所冗余，所以我们现在做注释的话还是用NR，因为这个数据库是最全的。另外NT是核酸数据库。

问20：如果序列太短，NR比对上的结果比较长，怎么预测？

答：你的意思是说你组装出来的序列很短，但是NR里面的同源蛋白序列却很长，这怎么预测的问题？这同样的，就是说你的序列很短，但是能够在NR里面找到序列同源的部分，那么就把NR里面同源的部分提出来，同源的部分把他翻译成氨基酸序列。当然序列是不完整的，这是毫无悬念的。

要么序列装得很长，那么翻译区域就要往前挪几步找到翻译的起始位点，来翻译成CDS。而序列太短这种情况，属于拼接不完整，这个时候也需要通过NR的一个比对结果，找到一个中间的位置，看什么时候开始翻译的，所以也是通过这样来预测的。

问21：拼接中的gap填充怎么理解？

答：你指的拼接是DNA水平的拼接还是RNA水平的拼接。转录组拼接的话，trinity是没有gap的概念，是基于延伸的方法。

问22：PFAM是用HMMER做的吗？

答：是用HMMER算法做的。

问23：为什么高通量测序会有很多没有比对上的序列？

答：这个问题问得很好。目前做高通量测序的话，无非有2种情况，注释率高的话有70%多，低的话50%多，剩下就有很多没有注释上的。

这里有两种可能，第一种：转录组结果里面是有一些非编码基因的，非编码基因肯定比对不上蛋白库；第二种，如果你测的物种是一些比较偏的物种，它毕竟有一些基因是比较特异的，所以在找不到近缘种的情况下，很多基因可能就会注释不出来。就是说找不到蛋白。因为NR库里都是一些比较偏模式的种，所以可能存在找不到同源蛋白的时候。所以序列就注释不出来。

问24：转录组测序得到的序列是一个连续的部分序列是吗？

答：对的，理论上是这样。转录组得到的序列大部分是不完整的，应该是你真正CDNA全长的一部分。

小瑶

问25：做完转录组分析得到注释后，要找自己需要的特异基因的方法除了用关键词在每个注释文件中查找并集之外再有没有其他比较快捷完善的好方法？

答：如果你关心一个基因的话，的确你用关键查找有一定风险。目前网络数据库基因的命名是五花八门的，可能这个基因在这个数据库是这个名称，在另外一个数据库是另外一个名称，有时用简写有时用全称，所以你用关键查找就有潜在的风险。

还有一种保险方法，比如你要研究A基因，然后你可以去NCBI或其他网络数据库把这个基因下下来，然后去你的转录组数据里面做blast，然后把能找到同源基因的把他调出来，这样就比较保险的。这样无论关键字叫什么，但是blast是跑不掉的。所以你直接去做比对是比较靠谱的。

问26：不抗病的品种里面和抗病品种都有着同样的抗病基因，怎么解释？

答：植物抗病这块可以了解一下相关文献（文献已共享到群文件）。因为抗病的机理很复杂，比如有一种叫TAL这种模式的，TAL模式就是所包括启动子结构不一样，TAL模式的全称应该是微生物的毒力基因在植物体内起到类似一个转录因子的作用，会转录某些基因表达。那么，抗病基因的的启动子结构就会影响个体有没有抵抗性。比如启动因子如果整好能够被微生物基因识别而表达，那么就可以起到抗病的效果。如果启动子区没有这个特异结合位点就启动不了免疫反应。植物抗病总体来说是比较多样的问题。如果是R基因的话，更多的是序列的有或无。

还有以一种情况是，不仅是有或无，还有序列的差别，比如抗病基因上发生SNP，突变或插入缺失。然后改变基因的特性，这也是有可能的。另外一种就是启动子结构，大家可以注意一下。

问27：新基因怎么定义？是没比对上还是比对为unknow？

答：如果你找新基因，原则上你应该这么做，比如转录组后你得到一个蛋白，得到转录组数据，理论上转录组注释有三级注释。第一个就是blast结果，能够注释上的。第二级注释的话是es-sgap来注释，就是说根据我们的序列级来注释一部分CDS序列。第三极的话是，就是你无法找出他潜在的编码方式，但这种找不到编码方式有两种情况，一种是lncRNA，一种是的确找不到同源蛋白，这种情况的话就是第三类了。这种情况下，你可以做个蛋白组，用蛋白组来作为参考。用第二级和第三级来注释一下，看看这个蛋白是不是真的存在的，如果在蛋白组里验证出来真的是有存在的，后期再做一些其他实验去验证，那么这个基因可能是真的存在的新基因了。当然，这个涉及到后面的实验，工作量会比较大。不过转录组找新基因是很少会去涉及的，更多的是去做一些已知基因的分析。

问28：为什么说转录组找新基因会很少涉及？

答：理论上找新基因有这样一个逻辑，转录组分析以后把他翻译成蛋白，如果真是是一个新基因，原来没有的话，这个基因是注释不出来的。所以序列肯定是属于最后在蛋白库里找不到同源的的这部分的序列。这部分序列你要证明它的话，必须要有蛋白注释率的支持。那你要做蛋白注释支持的话，是肯定要做蛋白质谱的实验。但做蛋白质谱本身也要依赖库的注释，因为你是新基因的话，库里面也没有，那么就可以考虑转录组为库来注释。那么就是你未知的蛋白，找不到同源蛋白，你要把他翻译成氨基酸，理论上的有两种策略，第一种就是es-scap,以已经翻译好的氨基酸作为序列集，去预测剩下不可翻译的CDNA的序列，这是第一种情况。如果这还搞不定的话，只能用最土的办法，6框阅读了。理论上你给一条DNA序列，你正向读反向读，每种都有3种读法，那么一共就有6种读法。那么就是说一条序列有6种读码框方式，那么你生成潜在的新基因序列的时候，你再用你的蛋白数据去做匹配，看看这些新的CDNA序列再蛋白的数据里面能不能找打匹配的信号。如果真的匹配上，可能就是真的新的基因了。那么就可以围绕这个再做一些分析。比如这些新的基因里面还有一些新的结构域什么的。所以这块是比较难研究的，如果你真的找到新基因，有蛋白数据支持的话。

问29：转录组数据是不是可以反转录最后用于基因克隆？

答：因为目前转录组结果拼出来的序列往往不是完整的转录本，所以如果你要反转录做基因克隆的话，建议先做5/3'-RACE，得到全长以后再做克隆。除非很确定目标基因组装是完整的，可以比一下同源基因看看，起始终止密码子是否是完整的，如果是完整的就ok没问题，不完整的话就要坐RACE实验。

问30：2个转录组互相比对的时候可以用blast吗？

答：当然可以。建议用blast本地化，比较方便。

问31：转录组和蛋白质组关联的时候，无参的，如何确定这转录组和蛋白质组的是一个基因的？

答：这个建议你做蛋白分析的时候，直接用转录组数据作为参考。因为蛋白是质谱数据，建议用转录组数据直接参考蛋白库，来做蛋白库注释，这样就自动把两个数据关联在一起了，不然后期做关联是非常麻烦的。

问32：转录组比对基因组用什么软件？

答：转录组比基因组可以用BLAST，也可以用BLAT。推荐BLAT，BLAT对于分段比对有优势。

问33：如果用bowtie2比对几个转录组的集合，和分别比对集合中的单个转录组，结果是一样的吗？也就是单独比对的比对率相加等于一起比对是的总的比对率吗？我做的是环境转录组。

答：这里存在一个多重比对的问题。最后一个原始reads的话最后可能比对在多个参考序列上。看你用什么比对率，如果是totol比对率的话，那是一样的，但如果算unigene mapping的话就存在一个很大问题，肯定你比对好几个库的话，大部分都是多重比对的。既然你都要做，那么相信这几个物种是存在一定近缘关系的，最后你会发现几乎所有序列都会多重比对。所以不建议多个比对，我们建议一个一个比对，最后需要什么研究结果再去统计，这样会好一点。

顺便提一下，无论是在其他公司，哪怕是在基迪奥做，也可能会犯下面这种错误。目前一般注释的时候是分库的，比如NR至少分为3类库，植物库、动物库、微生物库。所以做注释的时候是不会做总库的，因为总库最后可能会有一些问题，比如做植物最后出来一个动物的基因，那么这就没有什么科学可比性了。或者做代谢通路的数据库，如果是做植物的，最后鉴定出来一个通路叫cancer什么的，那么这种结果就很可笑了。目前公司如果在没有分析错误的情况下，是至少将动物、植物、微生物这三种库是分开的，是分物种的。做环境也是类似的，建议比对的时候，选一个最佳比对的。最后保留唯一一个就可以了，减少冗余的结果。

问34：NR库要自己分开吗？

答：对的， 需要自己写脚本把它拆开的。

问35：NR库怎么把植物的和动物的数据分出来？

答：拆分NR库需要NCBI的taxonomy信息。

问：NCBI的taxonomy信息怎么看？哪里找，是先把NR全部下载下来再分吗?

答：NVBI的taxonomy信息ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy

问36：NR 与SWISSprot库的个数不一样是什么导致的？

答：是两个数据库，收录的序列数目当然有差别。

问37：NR库不是冗余吗？为什么不包含swissprot呢?

答：这两个是独立的库，不在包含的，一个是美国的，一个是欧洲的，是不同主体在运营。

小瑶

问38：转录组文库构建时，插入片段大小重要吗？和PE125或PE150有关系吗？

答：这个影响应该不是特别大。目前来说差别不大，PE125与PE150如果你后期要做可变剪接的话可能会有影响，但如果你做转录组没有太大区别

问39：注释为unknown的是怎么回事？还有的注释为hypothesis?

答：因为本身做注释的话，我们把A 的cDNA比到数据库里面的某个蛋白，这个的话，我们只是做一个文本提取，可能别人数据库里注释出了这个蛋白，但是基因名称那里却写了个unknown，或写了个hypothesis，这只能说当时做注释那人当时就没把配置做好，所以导致的。

问40：无参转录组测序不同倍性的同一物种，可以放到一起进行建库还是不同倍性的单独建库吗？

答：一旦涉及到多倍体样本，这个问题就有些复杂。不同倍性的样本肯定是各自建库的，分析时是否要放在一起，需要依据实际情况而定。

问41：无参的单倍体、二倍体和三倍体的植物转录组测序，在拼接时是按倍性分别拼接好还是不同倍性都拼接到一起比较好？如果分开拼接的话对比是不是有问题?

答：不建议做多倍体的混拼在一起，因为问题可能会很大。本身转录祖拼接的话是希望把它拼成单倍体。有多种倍性的话，那么做拼接的时候是做成单倍体还是三倍体呢。因为后面还要涉及差异分析的问题。所以建议在做实验设计的时候，做倍性相同的，尽量规避开那种倍性不同的个体做分析。比如你做三倍体与四倍体的差异分析，最后的话就很大问题。严谨的角度来说很难解决。比如你装六倍体，装出来的基因到底是2个基因的等位基因还是6个基因的等位基因。特别是那种异源多倍体问题就更大了。

如果是这个项目非做不可的话，建议做单倍体拼接，拼出单倍体的基因型，然后以单倍体做参考来做差异分析，这样的话是比较合理。因为三倍体最后分析肯定会很多冗余。

问42：我们做质谱了但是数据不是很好，蛋白质谱所得数据不一定是我们转录组数据所得的蛋白，这个有没有可能？

答：理论上，无论质谱数据好不好，蛋白数据都是来自样品的蛋白，所以蛋白测的数据不可能会离开转录组的数据。就是蛋白的数据理论上应该跟你转录组的数据是一致的。但如果不一样，那么质谱数据可能是有误差的，当然转录组拼接有没有错误或者翻译有没有错误最后导致你的蛋白无法一一对应，这也有可能。这属于信号检测的问题，而不是生物学问题。所以这是完全是有可能的。

问43：如果测个新物种，应该从什么角度分析呢？

答：这个问题太大了，首先还是根据你的研究目的，比如做中草药，可以做次生代谢通路；如果是做适应性的，找一些热性蛋白等相关基因来讨论等等。

问44：同一个基因的多个转录本一般是聚类之后取最长的作为代表序列，计算表达量是不是还要看所有的转录本?

答：转录组组装一般都是去冗余之后保留最长的一个结果。算表达量的话是最长的转录本。

问45：请问blast结果里这种小写的部分是什么意思？

答：是短重复序列。

问46：公司转录组结果的那个SSR引物设计没有什么打分或者什么的么？设计引物都有几万对了，后期要验证，那怎么选呢？

答：这里不存在打分问题。只是这些SSR有没有多样性问题。如果要验证，建议挑选一些motif比较多的SSR，这样多样性比较好，结果会好一点。另外验证也需要注意一下，因为你做的是转录组，要做验证的话，建议挑选那些有意义的基因去做验证，这样比较好。

问47：除了SSR验证是不是PCR也可以啊？

答：SSR的验证本身就是PCR的过程，然后跑胶。所以这个是包含关系并不是“或”关系。

问48：验证基因个数有没有要求？至少要多少才比较有说服力？

答：验证基因个数一般老师选择为十来个左右，没有固定标准。

问49：PCA图能说明所测样本间的重复性好坏吗？就是如果重复样本在PCA图上离得比较远，反而和另一处理离得比较近，是不是能说明样本重复性不好？

答：是的，的确是重复性不好。首先要看下差异性分析结果好不好，如果差异性分析有很大问题，那么就要考虑做一下调整了，比如把异常样本剔除掉，或调整一些参数或污染问题。

问50：两个重复在PCA上离得很远，但是差异分析R平方值达到了93%以上，怎么解释？

答：不同的计算方法之间会存在偏差，但是一般规律还是一致的。所以建议老师关注下样本中有无特别高表达的基因贡献率较大导致样本PCA偏离。

问51：pca横坐标和纵坐标是指两个主要影响因素吗？

答：是两个最主要的成分。

问52：要确定是哪两个主要成分，是不是要根据样品来分析?

答：两个主要成分以及各自贡献率

问53：那能不能不管PCA了，就认为重复性是可以的？

答：一般情况用PCA，重复性和相关性不是一个概念。

问54：皮尔森系数是不是有很多种计算方法？

答：只有一种计算方法，因为皮尔森只是一个公式而已。如果说是相关系数的计算方法的话，那还有可能有其他方法比如斯皮尔曼相关。

daizaozao

开挂

{:8_419:}

leo

谢谢 非常有帮助

martin1207

我看完啦，都好专业啊，加油

yang80

很好，都学习了，收藏1

cooper

学习了。PCA看重复性好坏，能否详细说明一下？

     

stoni

学习了，，

wangzhaoyi

感谢

chuankang17

万能的群，感谢啊

limbo111

谢谢分享

生信菜鸟圈

收藏了，感谢分享

liyongbo

视频讲解和下文中的一问一答都非常好，困了，准备睡觉，明天见，基迪奥。

caffemao

下载先来详细研究研究

一心

很好，都学习了

Chongsong

谢谢分享

袁浩

怎么没有视频了呢？谁能把视频传上来