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DSP空间蛋白在神经疾病研究领域中大展身手

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nanostring的GeoMx DSP空间技术(以下简称DSP)在众多推文中,常见的是用于分析肿瘤微环境中细胞异质性,或者是预后等研究。随着近年来针对神经疾病panel的逐步面世,使DSP的应用情景不断扩宽,在神经疾病研究领域中也发挥着重要作用,大有不出手则以,一出手就是顶刊的苗头。

DSP空间蛋白之所以能快速成为疾病领域的研究热点,究其原因是它具有“空间定位”独一无二的创新性,再加上局部视角的加持,使其成为挖掘新的生物标志物、新的治疗靶点、肿瘤分型的一把利器。那下面我们就以一篇经典案例,解析基于DSP空间蛋白技术如何揭示TREM2风险变异对阿尔茨海默病大脑区域特异性免疫激活和斑块微环境的影响。

DSP探索阿尔茨海默病的斑块微环境
Acta Neuropathol. IF=18.174

#研究背景#

阿尔茨海默病(AD)是一种退行性脑病,细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积、细胞内tau蛋白聚集是AD的特征性神经病变。这些神经病理变化的积累伴随着大脑固有免疫系统的激活,小胶质便是主要的细胞成分。有研究表明小胶质细胞中TREM2受体基因上的变异,可增加患AD的风险,因此,本研究旨在通过DSP技术揭示TREM2对斑块微环境中蛋白表达的影响,以及通过转录组探究TREM2和高AD病患中不同大脑区域的基因表达谱差异。

#实验设计#

RNA-seq:对高AD、TREM患者和对照组的大脑(海马体、额叶皮层和视觉皮层)冷冻组织和FFPE组织中提取的RAN进行转录组测序。

DSP分析斑块微环境:将从高AD、TREM患者中收集的FFPE大脑组织切片,脱蜡后,进行多重免疫荧光染色、孵育(含有约40种抗体的混合物),比如β淀粉样斑块、小胶质细胞和星形胶质细胞用抗泛β淀粉样、HLA-DR和GFAP的荧光标记抗体,细胞核用Syto13 (Thermo)染色;根据染色的形态学结果对感兴趣区域圈选(ROI),nCounter®平台对圈选区域进行蛋白定量后作后续分析。

*注:根据AD病理分期定义:无AD(12例)、低AD(14例)、中度AD(6例)、高AD(17例)、TREM患者(TREM2 p.R47H(15例),TREM2 p.R62H(2例))。且所有TREM2病例均表现出高AD神经病理改变,称为高“ AD (TREM2)”或“TREM2”。

#研究结果#

一、免疫学和分子实验揭示TREM2对小胶质细胞、Aβ和tau蛋白的影响

根据前人报道,AD疾病的发展主要与小胶质细胞、以及Aβ淀粉样蛋白和tau蛋白沉积有关,因此前期作者花费很多篇幅,结合免疫组织学和分子实验验证AD患者队列在不同疾病阶段(无AD、低AD、中度AD、高AD、TREM2(携带TREM2遗传风险变异的高AD患者)),不同大脑区域(海马体、额叶皮层、视觉皮层),的小胶质细胞、Aβ和tau蛋白的差异。下面简单回顾下这部分的主要结论:

①本文将小胶质细胞的形态分为三个阶段,分别是稳态 (图1a);活化 (图1b);衰老(图1c)。

高AD Vs TREM2病例:Aβ和tau蛋白没有差异(图1g,k,o);小胶质细胞形态没有差异(1h-j、1l-n);TREM2中衰老小胶质细胞更丰富(图2),暗示TREM2遗传风险变异可改变小胶质细胞的活化状态;与额叶皮层中的高AD相比,TREM中斑块相关小胶质细胞减少(图3a,b);两者的Aβ沉积并无差异;但TREM2中神经炎斑块的数量(图3f-h)和磷酸化tau覆盖的总面积更高(图3i-k);在额叶皮层中最为明显(图3d、g、j)。

图1 小胶质细胞激活跟随AD神经病理学变化的进展

*海马体 (d-f)、额叶皮层 (h-j) 和视觉皮层 (l-n) 中稳态、活化和衰老小胶质细胞的百分比以及三个区域(g,k,o)Aβ和tau病理。

图2 不同疾病阶段衰老小胶质细胞的平均百分比(合并所有区域)

图3 TREM2变异携带者斑块相关小胶质细胞减少、神经炎斑块增加和整体 tau病理学增加的ANOVA统计结果

*a斑块相关小胶质细胞的代表性显微照片(Aβ,红色;小胶质细胞,绿色);b量化每个斑块面积 (μm2) 的小胶质细胞数量;c-k海马所有解剖亚区 (c,f,i)、额叶皮层 (d,g,j)和视觉皮层 (e,h,k) 的Aβ斑块覆盖百分比、神经炎斑数、tau覆盖的百分比面积。

③匀浆中总tau蛋白的蛋白质印迹分析显示,高AD和TREM2没有差异,但TREM2中不溶性磷酸化tau蛋白显着增加(图4a-c);通过ELISA也揭示了高AD和TREM2的Aβ没有差异(图4h,k,n)。TREM2病患中小胶质细胞屏障功能降低会增加Aβ诱导磷酸化tau病理学,因此观察到TREM2中不溶性磷酸化tau与不溶性Aβ的比值显着增加(图4g-o)。

图4 TREM2病例中Tau和Aβ的的蛋白质印迹以及ELISA分析

*a-f Western blot分析上清液(a-c)和沉淀(d-f)中的不溶性tau蛋白(a,d总tau蛋白(红色);b,e磷酸化tau蛋白(绿色)和(c,f)覆盖);上清液(g)、沉淀(j)以及(m,上清液+沉淀)的tau定量;不溶性Aβ42上清液(h),沉淀(k)和总(n,上清液+沉淀)的定量;i,l,o不溶性tau和不溶性Aβ42的比值。

二、dsp空间蛋白揭示AD和TREM2病例在斑块微环境方面的差异

前期研究中未发现TREM2和高AD病例中活化小胶质细胞百分比的较大差异(图1),但发现TREM2变异可减少了斑块周围的小胶质细胞积累(图3a,b),因此通过DSP技术进一步揭示高AD和TREM2病例斑块微环境的差异情况。

2.1 ROI区域蛋白表达谱绘制‍

如图5,40种蛋白质的聚类热图所示,在TREM2和高AD病例中,三个斑块周围不同的ROI区域(Mask1指斑块中心,Mask2指中间环,Mask3是每个斑块的最外环)的蛋白表达有所不同。其中与更外围的区域(Masks 2和3)相比,明显Mask 1区域的TREM2和高AD病例蛋白表达情况更为相似;但与两组相比,Mask 1中的大量蛋白质仍然存在显著差异。并且,TREM2和高AD病例聚类在Masks 2和3两个区域显示出更显著的差异,表现出多种蛋白产物的改变。

图5 TREM2和高AD患者ROI区域(斑块周围的三个区域Mask1,Mask2 和Mask3)的蛋白表达谱

2.2 不同区域间差异分析‍

挑选每个实验组六名患者的额叶皮层切片周围10-20个Aβ斑块的三个同心圆(Mask1,Mask2 和Mask3),进行不同ROI区域间的差异分析。蛋白质变化的径向热图结果显示(图6),高AD和TREM2病例斑块微环境之间存在显著差异。

图6 多重蛋白质分析靶向图像(左)&蛋白质定量径向热图(右)
*a、b左图:绿色=Aβ、黄色-Iba1、蓝色=细胞核

2.3 tau蛋白和Aβ蛋白的差异分析

对单个蛋白进行更详细的差异分析,结果如图7,TREM2和高AD病例斑块周围所有区域中tau蛋白和磷酸化tau(pSer396/pSer404)的表位都有所增加(图7d);但Aβ40和Aβ42的水平却没有差异(图7e),DSP结论印证了常规组织学(图3g,j)和生化数据(图4a-c)。

图7 TREM2和高AD病例微环境中的tau蛋白和Aβ蛋白的差异分析

三、TREM2和高AD病例的不同解剖区域基因表达的差异分析

最后作者还通过NanoString的神经病理学和nCounter Neuroinflammation panel技术对高AD和TREM2病例的海马、额叶皮层和视觉皮层样本中基因情况的差异进行了比较。

①神经病理学绘制的通路评分显示,高AD和TREM2病例的大脑区域中,多条通路存在显著差异(图8a, b);另外,nCounter Neuroinflammation panel通路评分的GSA((gene set analysis)分析也显示高AD和TREM2之间也存在显著差异,并在不同的脑区趋势相反(图8c)。

②与高AD患者相比,TREM2视觉皮层中星形细胞活化(pan reactive,A1和A2)和小胶质细胞活化(all DAM,stage1 DAM和stage2 DAM)相关通路下调(图8c, 9c)。这与组织学分析中观察到的视觉皮层中激活的小胶质细胞比例较低的趋势一致(图1)。

③相比之下,TREM2 病例在额叶皮层(图8c)中表现出更多的“促炎”特征,具有星形胶质细胞(pan reactive、A1和astrocyte function)和小胶质细胞相关通路(all DAM和stage1 DAM)与高AD相比被上调(图9b)。

④在海马中,小胶质细胞相关通路(all DAM、stage1 DAM和stage2 DAM)在TREM2病例中再次上调,但星形胶质细胞相关评分(pan reactive和 A1)低于高 AD 病例(图9a)。

图8 不同解剖区域和TREM2变异携带者的基因表达模式的差异

图 9 高AD和TREM2病例海马 (a)、额叶皮层 (b) 和视觉皮层 (c)通路评分的热图

#文章小结#

本研究以常规规组织学和生化数据打头阵,先提出了一部分结论,同时又遗留一部分问题(TREM2和高AD病例活化小胶质细胞百分比无差异,且TREM2变异可减少了斑块周围的小胶质细胞积累)给DSP空间蛋白深入到斑块微环境研究,创造机会;最后又补充上转录组的数据,从临床到空间再到分子内部,全面揭示了阿尔茨海默病的疾病机制,以及隐藏的潜在靶点。

总结

最初,dsp空间蛋白的出现更多的是为肿瘤、免疫、微环境服务,但随着GeoMx DSP产品的发展,目前针对神经疾病的panel也在不断的完善,尤其是用于比较典型的阿尔茨海默症、帕金森、胶质细胞分型等研究。目前dsp技术可以说在神经研究领域中也是被寄予厚望的,当然,由于其在空间原位上的开创性,也从未辜负大家的期待。普通的组学只能解释二维的信息,加上空间特征是目前高分文章的首选。就像本文,做了很多的生理生化的实验,最终还是要补充上dsp微环境的精细化研究,来进行更深层次的探讨,这对揭示人类神经疾病的区域异质性具有重要意义。关于DSP空间蛋白组在神经领域的推文就介绍到到这里啦,近期有做DSP空间蛋白组的小伙伴们可以联系基迪奥哦!

参考文献
[1]Prokop S, Miller KR, Labra SR, Pitkin RM, Hoxha K, Narasimhan S, Changolkar L, Rosenbloom A, Lee VM, Trojanowski JQ. Impact of TREM2 risk variants on brain region-specific immune activation and plaque microenvironment in Alzheimer's disease patient brain samples. Acta Neuropathol. 2019 Oct;138(4):613-630. doi: 10.1007/s00401-019-02048-2. Epub 2019 Jul 26. PMID: 31350575; PMCID: PMC6939638.

本文作者:基迪奥-基迪奥-潇潇   

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