查看: 448|回复: 8

[多样性测序] 如何基于宏基因组+转录组揭示微生物群落结构,宿主功能变化

[复制链接]

管理员

Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

主题
666
注册时间
2020.6.16
在线时间
386 小时

发表于 2022.5.23 10:18:48 | 显示全部楼层 |阅读模式
粮食安全相关研究,一直是国家比较关心,扶持的。尤其是在当前错综复杂的国际形式下,将粮食安全作为一个专题,是一种重要的战略调整。前两期的粮食安全微生物文章中,分别给大家介绍了物种-物种(16S+ITS)、物种-微生物功能(16S+宏基因组)的关联策略。本次依然将粮食安全与微生物作为一个引题,主要探讨,如何基于宏基因组+转录组研究微生物与宿主功能之间的作用机制。

一、宏基因组与转录组的关联思路

宏基因组与转录组的关联策略概括为以下两种,一种是宏基因组+宏转录组,另一种是宏基因组+宿主转录组。这两种关联思路是由微生物的生存方式衍生的。在自然界中,根据微生物的生存状态,人为的将其划分为两大类。第一大类,像一些河流、土壤、工业发酵中的微生物,它直接暴露于自然环境中,称为非生物因素相关的微生物;第二大类是与生物因素有关联的微生物,比如动物(人)胃肠道、植物根际、叶片等等,这类微生物比第一种多了一个宿主因素,往往分子机制更复杂。

那相应的针对上述两类微生物,微生物内部的分子网络,也分为两种。第一种是在一个环境内,只有微生物自己,微生物会与不同物种,或者周围环境因子(PH,温度)等等会发生一些关联,同时在每一个微生物个体内部也涉及DNA-RNA-Pro-代谢物这样一个运行过程。因此非生物因素下的这些微生物,主要是个体内部分子之间的一个相互作用,再包括外部物种间,环境因子等影响,最终才是我们看到的某一个微生物“表型”,那针对这种微生物我们一般选用宏基因组+宏转录组的关联策略,只关注微生物,研究其群落结构,分子层面的功能特征;而生物因素下的微生物分子网络,由于加入了宿主,就涉及到两个个体(微生物和宿主),两套中心法则(微生物个体内部的和宿主的),之间的一个交互影响,影响表型的因素就更加复杂,因此一般我们即可选择宏基因组+宏转录组的策略(只探讨微生物),也可用宏基因组+宿主转录组,分别探讨处理效应导致微生物以及宿主转录分子层面的差异,进而预测微生物和宿主的差异关联机制。

二、宏基因组与宿主转录组的应用情景


  • 中文标题:促进水稻超高产的土壤微生物机制
  • 发表期刊:Soil Biology & Biochemistry
  • 影响因子:5.795

研究背景

提高水稻产量潜力对全球粮食安全至关重要。中国桃园作为一个特殊的超高产水稻生态区而闻名于世,但促进此地超高产的潜在分子过程和环境机制仍然未知。本研究旨在通过16S/ITS/宏基因组,揭示水稻四个关键生育期的土壤微生物群落结构和功能特征,并辅佐水稻根组织转录组测序,确定水稻超高产的土壤微生物机制。

实验设计

16S/ITS/宏基因组:在Taoyuan(TY)和Jinghong(JH)两个地区采集分蘖期(S1)、幼穗期(S2)、孕穗期(S3)和灌浆期(S4)水稻的土壤样本,三个重复,共24个土壤样本进行微生物群落结构和功能研究;

转录组:取TY和JH两地分蘖期(S1)和孕穗期(S3)根系组织样本进行宿主功能研究。

实验结果

1. 16S/ITS揭示土壤微生物群落结构特征

本文首先对非生物因素中(土壤)的微生物群落结构进行探讨,结合时间(S1- S4时期)、空间(TY和JH)取样信息,表征真菌、细菌群落结构(多样性、物种组成)的差异,主要结论如下:

①群落α多样性分析:Shannon指数+统计学(ANOVA方差分析,p<0.01)表明,TY细菌物种丰富度高于JH,特别是在S1和S2期。真菌与之相反,且越到后期,桃园的丰富度越低(图1A);

②群落β多样性分析:PCoA图(未加权和加权的UniFrac距离)显示,TY和JH的两个细菌群落明显分离(有差异)。而真菌(加权UniFrac距离)样本呈聚集状态(图1C)。

Tips
αβ多样性通常以样本或分组对群落整体贡献进行展示,结果并未涉物种信息,因此常说αβ多样性本质上是从整体层面来揭示群落差异,一般放到文章的第一部分进行讨论。在确定了群落组间丰富度以及聚集状态具有差异后。进一步深入到物种层面,看造成表型差异的具体物种有哪些。

③OTU层面的veen差异分析:TY特有的16S-OTUs比JH多,但ITS-OTUs比JH少(图1B)。

④门水平物种组成分析:两个地区的物种(真菌、细菌)分布有显著差异。细菌层面,Proteobacteria变形菌门(33%-37%)、Actinobacteria放线菌门(17%-27%)和Chloroflexi绿弯菌门(8.5%-6.8%)是两地最丰富的类群,但只有绿弯菌门在两地有显著差异;真菌层面,TY的优势菌门,Ascomycota子囊菌门随生长阶段增多,Basidiomycota担子菌门减少,JH则呈现相反的趋势(图1D)。

图1 TY和JH水稻四个时期细菌和真菌的土壤微生物群落结构

2. 宏基因组补充土壤微生物功能特征

知道了土壤生境中都有什么物种后,那接下来通过宏基因组研究这些微生物能行使什么功能,具有怎样的代谢通路:

① 基于reads的KEGG数据库注释显示:共鉴定了5386个基因;

②群落β多样性分析(基于KO基因的):PcoA降维聚类显示TY和JH两地的功能多样性具有显著差异(图2A)。

Tips
宏基因组测到的是细菌全部基因组(约3M),它除了可得到物种的丰度信息,还能知道基因数据,因此对于宏基组来说αβ多样性分析,既可以基于物种又可以基于基因,这点与16S有本质的区别。宏基因组可以全方位提高文章的深度,是微生物群落研究的首选策略。

③差异KO基因筛选:火山图显示与JH相比,TY总共有1898个KEGG Orthology(KO)基因(占所有KO基因的35.4%)显著上调,464个KO基因(8.6%)显著下调(图2B)。

④组间功能差异分析:对上述的差异基因进行KEGG(lev3)代谢通路注释,发现TY显著富集了肽酶(PD)、细胞膜和胞内结构(MIS)和转运蛋白(TraP)三个功能群,其丰度分别是JH的12.5、28和5.9倍。并且,TY的富集功能在不同生长阶段之间没有差异(p>0.05)。此外,核糖体、原核生物固碳途径、氧化磷酸化、柠檬酸循环(TCA循环)、光合生物固碳、C5分支二元酸代谢、丙酸酯代谢等7个功能群在TY显著降低。这些功能与能量代谢和碳水化合物代谢有关,属于管家基因。

图2 两地土壤微生物群落功能

3. 环境因子对土壤微生物群落氮循环影响

环境因子分析对于探究微生物变异十分重要,如果说基因组,转录组,蛋白组等组学技术的关联是为了从微生物内部的分子网络去破译群落差异的本质,那环境因子就是非常重要的外部指标,因此接下来重点讨论理化性质和气象因素是如何影响土壤微生物群落的。

典型相关分析(CCA)结果表明:土壤理化性质对细菌和真菌群落的影响高于气象因子。土壤pH、TP和NO3−与TY细菌群落结构(r2=0.93,0.76和0.82)以及真菌(r2=0.99、0.91和0.92)显著相关(图3A和B)。

pearman相关性热图也显示:高度丰富的门水平微生物与pH、TP和NO之间也存在显著的正相关关系(图3C)。

图3 土壤理化性质和气象因素与土壤微生物群落的关系

#(A)细菌和(B)真菌的CCA分析:SOC:土壤有机碳,TN:总氮,TP:总磷,NO3−:硝态氮,NH4+:铵态氮,MMT:月平均温度,MP:月降水量,MRH:平均相对湿度,MTD:平均温差;Spearman热图:红色表示正相关,蓝色表示负相关,p<0.05。

4. 转录组揭示宿主水稻氮素同化的功能机制


在环境因子分析中发现了土壤理化性质(NO3−等)对微生物的影响作用,接下来补充根组织宿主功能机制,看微生物对土壤理化性质的敏感性,是否和宿主的基因表达存在关联。

田间试验表明,TY水稻具有较高的氮吸收和利用能力(图4A)。且有报道称水稻植物在四个关键阶段(S1-S4)的转录组差异表达基因在氮化合物代谢过程中富集

因此在以上理论基础上,本研究基于根组织的转录组也发现,所有硝酸盐转运蛋白基因在TY的表达始终比在JH高5.26倍在S1时期(图4B)。且与水稻高产相关的转运蛋白在TY稻和JH稻之间存在显著差异(图4c)。  

图4 两地水稻的氮素同化研究

#(A)不同氮肥方案下TY和JH的水稻产量;(B)在S1和S3期间,两地水稻根中铵转运蛋白(AMTs)和NRTs的FPKM;(C)在S1和S3阶段,与水稻高产相关的特定转运蛋白在两地的差异表达。

5. 宏基因组土壤微生物的硝化途径与宿主转录组联动

发现了能促进土壤氮循环的环境因素以及水稻氮素同化的代谢途径后,宏基因组继续揭示土壤微生物的硝化途径:

①在TY的土壤中观察到NO3﹣含量较高,而NH4+较低,且TY微生物组中硝化途径基因(氨氧化酶(amo A/B/C)、羟胺氧化还原酶(hao)和一氧化氮双加氧酶(nod,己糖单磷酸途径(hmp)酶))丰度显著高于JH微生物组(图5A和B);具有硝化功能(KO ID)的属(5B和5c),例如,亚硝基单胞菌(有amo酶基因),生孢噬纤维菌属和Starkeya(均有hmp酶基因);弗兰克氏菌属、束毛蓝细菌属(则具有hao酶基因)在TY中具有较高的丰度。

暗示TY中,这些富集的氮代谢的功能类群以及参与硝化过程的基因,促进了NH4+转化为NO3−,以及引起水稻根系中硝酸盐转运蛋白的高表达。与宿主转录组的数据形成了很好的联动。

图5 土壤微生物氮循环

#(A)微生物氮化合物在土壤中的转化途径(Kuypers,2018年),实线表示本文的宏基因组数据基因能识别的通路。虚线代表文献中报道有,但在本文数据集中未发现相关基因。(B)TY和JH土壤氮循环基因在四个生长阶段的相对丰度。(C)微生物属中基因的相对丰度在氮循环中或在文献中报道为可能具有硝化功能。

Tips
在很多微生物+宿主转录组的关联分析中,两个组学大多会基于相关性研究(或者是O2PLS和 CCA模型),推测微生物变化对宿主通路的影响[1]。

总结

本文基于宏基因组+宿主转录组的多组学策略,分别从微生物和宿主功能层面分开讨论。微生物数据基于土壤样本获得,16S/ITS主要提供物种,以及外部环境因素对两地差异的影响,发现无论是群落多样性还是物种,TY的细菌均高于JH,表明细菌可能才是驱动变异的主要微生物群;进而也找到了土壤理化性质是关键的环境因子因素,与后续的宿主转录组功能结论相辅相成;   

微生物的机制清晰后,进一步基于根组织加入宿主转录组的相关数据,发现了在TY中显著富集的硝酸盐转运蛋白基因,并且TY中一些水稻高产相关的转运蛋白也显著高于JH稻,揭示了水稻高产的分子机制;最后宏基因组土壤微生物的硝化途径表明TY中,这些富集的氮代谢的功能类群以及参与硝化过程的基因,促进了NH4+转化为NO3−,以及引起了水稻根系中硝酸盐转运蛋白的高表达,与宿主转录组的数据形成了很好的联动。每个组学的数据在本文中都得到了很好的利用,宏基因组与宿主转录组结论上的呼应更是为本文增添不少色彩。

▼参考文献▼
[1]Malmuthuge N, Liang G, Guan L L. Regulation of rumen development in neonatal ruminants through microbial metagenomes and host transcriptomes[J]. Genome Biology, 2019, 20(1): 1-16.
[2]Zhong Y, Hu J, Xia Q, et al. Soil microbial mechanisms promoting ultrahigh rice yield[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2020, 143: 107741.

        
本文作者:基迪奥-潇潇


本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2016.6.23
在线时间
61 小时

发表于 2022.5.23 10:55:13 | 显示全部楼层
学习学习学习
新的一天加油!
回复 支持 反对

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
101 小时

发表于 2022.5.23 12:51:55 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
3
注册时间
2021.6.22
在线时间
54 小时

发表于 2022.5.23 22:37:34 | 显示全部楼层
周五啦!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
2
注册时间
2016.12.5
在线时间
151 小时

发表于 2022.5.25 11:04:10 | 显示全部楼层
赞赞赞,学习了,学习了
回复 支持 反对

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2021.1.28
在线时间
30 小时

发表于 7 天前 | 显示全部楼层
顶!!!!!!!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2021.1.28
在线时间
30 小时

发表于 6 天前 | 显示全部楼层
顶!!!!!!!!!!!!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2021.1.28
在线时间
30 小时

发表于 5 天前 | 显示全部楼层
顶!!!!!!!!!!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2021.1.28
在线时间
30 小时

发表于 4 天前 | 显示全部楼层
顶!!!!!!!!!!!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表