查看: 746|回复: 7

[其他] m6A-seq各种提取扩增策略,你学会了吗?

[复制链接]

管理员

Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

主题
666
注册时间
2020.6.16
在线时间
386 小时

发表于 2022.3.22 09:38:48 | 显示全部楼层 |阅读模式
一、m6A-seq的建库策略

当我们信心满满开始设计好实验分组、采集样本,打算进入m6A甲基化这片科研蓝海里畅游之际,却被建库策略拦住了去路。同样是m6A测序,不同实验研究目标,成本方案都需要匹配的实验建库策略的设计。对于第一次接触m6A测序的科研人来说,十分有必要了解不同建库方案之间的异同,根据自身研究内容挑选合适的建库策略,才能在m6A研究领域立足脚跟,有所作为。

m6A-seq我们需要了解两方面建库内容:1.RNA提取方案 2.序列扩增方案,两者间可以搭配出不同组合,接下来我们来盘点一番此中细节。

m6A-seq常用提取、扩增方案表

二、RNA提取

对于RNA提取,常见有三类方案:1.polyA提取;2.total RNA提取;3.环状RNA去线性提取。

1. polyA提取法

适用于:真核生物成熟mRNA研究

绝大多数的真核生物的成熟mRNA在其结构3’末尾处存在80-250个腺苷酸残基(A碱基)构成的多聚腺苷酸链,这个结构被大家亲切的称为polyA尾巴。polyA尾巴的产生不依赖于DNA,当转录过程终止时,核酸内切酶识别到信号进行剪切,释放出前体RNA,随后多聚腺苷酸聚合酶就会在前体RNA的3’末端逐个加入腺苷酸,形成polyA尾。获得polyA的RNA结构能更加稳定不会轻易降解,此外PolyA结构对于RNA出核以及后续的RNA翻译过程也起到了必要作用,因此polyA结构是RNA成熟的一个重要标志。

图1 真核生物成熟mRNA结构示意

当我们寄送样本或前期提取好的总RNA到测序公司时,样本/RNA中包含着各种类型的RNA,有编码RNA(mRNA)、各种非编码的RNA(rRNA、lncRNA等),对于只关注编码RNA的研究项目来说,各类非编码RNA属于干扰项,需要尽可能减少这些RNA对结果的干扰,这时候采用polyA提取法就是一个不错的选择。

通常,polyA提取会采用Oligo(dT)磁珠,这是一种表面共价偶联了寡聚dT序列的磁珠,可以和mRNA的polyA尾之间形成碱基互补配对,从而保留下mRNA用于后续建库分析,提取出高纯度的mRNA,减少其他类型RNA对结果的干扰。

2. total RNA提取法

适用:同时关注编码、非编码RNA甲基化修饰的研究

m6A广泛存在于各类RNA中,例如就有研究报道lncRNA上存在着大量的m6A甲基化修饰[1],这些m6A修饰可以通过影响lncRNA结构、影响RNA结合蛋白的结合效率、竞争结合miRNA等方式影响相关基因表达,从而间接调控下游相关功能与表型。

图2 m6A-lncRNA竞争结合miRNA[1]

对于关注mRNA的甲基化修饰同时也关注lncRNA等非编码RNA甲基化修饰的项目,常规的polyA法不能完全满足我们的研究需求,需要采用total RNA提取方法。需要注意到的是在常规细胞、组织样本中RNA类型很多,其中核糖体RNA(rRNA)是占比最高的RNA,约占RNA总量80%,这类rRNA分子量比较大、代谢不活跃,对于这类RNA我们需要进行去除,以保证其他类型RNA数据结果能正常分析。

目前rRNA去除方法主要有两种,一种是通过探针杂交捕获rRNA再采用磁珠吸附去除,这类方法称为Ribo-Zero-seq,另一种则是采用特异性核酸酶处理消化rRNA,称为酶消化法。通过这些方法可以将rRNA去除,且保留下其他各类编码、非编码RNA用于后续转录调控测序、分析。

3. 环状RNA去线性提取法

适用:专注于环状RNA的m6A研究

在过往的共识中,仅mRNA能够进行翻译,环状RNA被认为是不能够编码蛋白的一类非编码RNA。随着近几年研究的深入,人们逐渐发现某些环状RNA是具有编码能力的,其中m6A对环状RNA的翻译过程起到了巨大作用。m6A修饰的环状RNA能够被YTHDF系列读取蛋白识别并结合,之后不断募集翻译相关的蛋白进一步结合,最终启动环状RNA的翻译过程。

图3 m6A参与环状RNA翻译示意图[2]

与mRNA、lncRNA等线性RNA不同,环状RNA呈现封闭的环状结构,不受RNA外切酶的影响,不容易降解。因此为了能够准确提取到样本中的环状RNA,常采用RNA酶对各种线性RNA进行消化、降解,留存下来的就是高纯度的环状RNA,这样能尽可能保证分析的结果少受线性RNA的干扰。

三、扩增建库方案

获得了目标RNA后,接下来就需要将RNA进行扩增,建立测序文库。

常规建库方案,我们先将RNA逆转录为双链cDNA,基于双链cDNA进行扩增建库,这种方案存在一个缺点,即测序结果无法获知reads来自于正链还是负链。lncRNA等具有来源具有链特异性的RNA研究需要来源链信息,因此我们需要采用链特异性方案进行测序文库构建。

与常规扩增方案不同,链特异性建库首先采用随机引物扩增出第一条cDNA链,在扩增第二条cDNA时采用dUTP代替dTTP,之后采用UNG酶进行处理,消化降解第二条cDNA,使得双链文库仅剩一条链,基于这条链作为扩增模板,通过接头序列顺序即可在比对基因组过程中获得所属正、负链信息。

四、小结

RNA的m6A甲基化研究是个大而广的领域,不同物种、不同表型都能够从m6A这个独特角度这个角度入手研究调控机制,了解并掌握各种m6A提取、建库策略有助于我们获得理想的数据结果,少走弯路。


五、文末福利

想深入学习m6A数据分析吗?还想了解更多表观组学分析思路、文章案例以及数据分析吗?快来参加基迪奥本月举办的表观组学线上培训班吧!

基迪奥生物拥有众多表观组学项目经验,本次培训课程结合项目经验与前沿文章趋势为你讲述不一样的表观组学,培训将讲授表观组学研究思路、单组学个性化分析,进阶至多组学关联策略。

从reads可视化到丰度表的基础数据分析、多组学关联分析,3天培训将带您体验从表观组学测序数据可视化及个性化分析的完整流程。

时间:
2022年03月28日-30日
授课形式:腾讯会议 线上直播授课
报名费用:1200元/人

优惠福利满足以下任一条件可享受999元/人优惠价格
1. 报名转录组培训班或曾参加基迪奥线上生信培训班
2. 3人及以上组团报名


报名方式

方式一:
扫描下方二维码,填写信息报名


方式二:
发送姓名、单位、电话到邮箱contact@genedenovo.com,主题注明“表观培训班”

客服:020-39341079或18054271626 邓小姐

▼参考文献▼
[1] Zheng ZQ, Li ZX, Zhou GQ, et al. Long Noncoding RNA FAM225A Promotes Nasopharyngeal Carcinoma Tumorigenesis and Metastasis by Acting as ceRNA to Sponge miR-590-3p/miR-1275 and Upregulate ITGB3. Cancer Res. 2019;79(18):4612-4626. doi:10.1158/0008-5472.CAN-19-0799
[2] Di Timoteo G, Dattilo D, Centrón-Broco A, et al. Modulation of circRNA Metabolism by m6A Modification. Cell Rep. 2020;31(6):107641. doi:10.1016/j.celrep.2020.107641

本文作者:基迪奥-阿拉雷            

本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
3
注册时间
2021.6.22
在线时间
54 小时

发表于 2022.3.22 10:04:27 | 显示全部楼层
周五啦!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2021.4.14
在线时间
14 小时

发表于 2022.3.22 10:14:59 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.11.22
在线时间
21 小时

发表于 2022.3.22 15:04:09 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.2.12
在线时间
106 小时

发表于 2022.3.23 08:32:28 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2021.1.28
在线时间
30 小时

发表于 2022.4.20 13:40:34 | 显示全部楼层
顶!!!!!!!!!!!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2016.5.10
在线时间
8 小时

发表于 2022.5.1 16:07:51 | 显示全部楼层
各种提取扩增,学废了
新的一天加油!
回复 支持 反对

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2016.10.11
在线时间
16 小时

发表于 2022.5.12 10:26:49 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表