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基迪奥客户连发高分文章验证circRNA在胃癌发展中的作用

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发表于 2021.12.11 11:40:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
CircRNA从1976年被发现,到2013年同一期刊Nature两篇circRNAs文章问世[1][2],一鸣惊人,成为非编码RNA领域新的明星分子,“雪藏”了几乎三十年(期间报道少许)。正如Arthur Schopenhauer所说,所有浮出水面的真理都需要经过三个阶段:第一,被嘲笑;第二,被强烈反对;第三,被认可且是不言而喻的。

那么环状RNA究竟是研究什么呢?我们先一起走进环状RNA,简单了解其特点与作用机制。


环状RNA特点:
1. 稳定。由于环状RNA所特有的共价闭环结构可以抵抗核酸外切酶的降解,因此相较于线性RNA,环状RNA在体外和体内都更加稳定;
2. 高度保守性。环状RNA在不同物种之间也显示出高度的保守性——例如小鼠体内有约20%的环状RNA与人类的环状RNA同源;
3. 主要定位于细胞质中。位于细胞质中的circRNA可能主要发挥竞争性内源RNA—ceRNA的作用。

图1 CeRNA作用机制[3]

环状RNA的作用机制:
1. 充当“分子海绵”,作为miRNA的竞争性RNA分子。因circRNAs含有许多miRNA结合位点,推测这些circRNA可通过与miRNA结合或与其他分子的相互作用进而在转录水平或转录后水平调控基因表达[4]
2. 编码功能。大量科研研究与翻译组技术结合,证实circRNA可以编码多肽,通过编码多肽进而行使调控功能(详见《基迪奥合作客户环状RNA高分文章发表!》)。

近年研究表明环状RNA广泛参与肿瘤的发生和发展,影响肿瘤的生长增殖和侵袭转移等过程。今天,我们和大家分享广州医科大学附属第五医院周新科教授团队连发的两篇环状RNA通过ceRNA机制对胃癌生物学功能影响的文章,总IF=19.63,揭示了circRNA可通过circRNA/miRNA/mRNA轴调控胃癌的发展进程,为胃癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点。

两篇文章在探索之路中都是先通过高通量测序缩小研究范围,找到目标circRNA。结合分子实验对该环状RNA的生物学功能展开分析。并以环状RNA为点延伸,寻找潜在作用的miRNA,形成一个完整的研究线。基迪奥再次通过高质量的专业服务助力合作客户实现持续的高分文章产出,接下来我们一起学习这两篇文章的研究思路。

  • 研究背景

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,且多数患者初诊可能已处于胃癌晚期,预后不尽人意。因此阐明胃癌发展、转移的分子机制,发现早期诊断和治疗的新型分子靶点迫在眉睫。

circRNA作为非编码RNA的“新星”,近年来被发现在多种分子机制中发挥作用。其中miRNA海绵是circRNA在肿瘤的发生发展中最常见的作用。尽管在胃癌中已有几种circRNA被报道,但很少有肿瘤转移相关的circRNA及其分子机制被报道。

『探索Hsa_circ_0001829调控人类疾病胃癌的分子机制』
Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,IF=11.161,2020.12)


   文章题目:环状RNA hsa_circ_0001829通过miR-155-5p/ SMAD2途径促进胃癌进程[5]
   发表杂志:Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
   影响因子:11.161
   合作单位:广州医科大学附属第五医院

研究目的

1. 分析hsa_circ_0110829在胃癌组织中的表达,探索该环状RNA对胃癌细胞增殖、侵袭和转移等调控作用;2. 解析hsa_circ_0110389在胃癌中发挥调控作用的分子机制,以期为胃癌诊断和治疗提供新的标志物。

样本及测序方案

细胞:GES-1-T(malignant-transformed human gastric epithelial cells,恶性转移人胃上皮细胞)、GES-1-N(正常人胃上皮细胞)、人胃癌细胞系(MKN-28、SGC-7901、MGC-803、BGC-823);
组织:20对GC(gastric cancer,胃癌)及癌旁组织;
测序方案:对处理组GES-1-T细胞和对照组GES-1-N细胞进行高通量测序。

文章思路

图2 文章思路

研究结果

分子筛选,找到主角“hsa_circ_0001829”
1. Hsa_circ_0001829在胃癌组织中表达上调

①分子筛选

为探究circRNAs在胃癌恶性转化中的潜在机制,采用去核糖体及RNase R处理RNA-seq分析环状RNA在GES-1-T和GES-1-N细胞中的表达谱。通过差异分析发现共4,650差异表达circRNAs,在GES-1-T细胞中1,509个circRNAs表达上调,3,141个circRNAs表达下调。利用qRT-PCR检测前10个表达上调的circRNAs,发现hsa_circ_0001829在胃癌细胞中上调变化最大,且在4种胃癌细胞系中均上调(图3 B、C)。

图3 hsa_ circ_0001829在胃癌组织和细胞中上调表达

②实验鉴定

利用Sanger测序鉴定qPCR产物证实了hsa_circ_0001829的头-尾剪接,并发现可抵抗RNase R的消化,且半衰期超过24h(图4 C),表明该circRNA在细胞中高度稳定。

图4 Hsa_circ_0001829的鉴定

功能研究—探索发挥的潜在作用

2. Hsa_circ_0001829对胃癌细胞功能的影响

对于基因分子功能的研究一般模式就是过表达和敲除验证,环状RNA也不例外。作者通过体外干扰和过表达实验全面探索该环状RNA对胃癌细胞的功能影响。采用CCK-8和EdU等一系列实验检测其对胃癌细胞增殖的影响。结果发现沉默hsa_circ_0001829后细胞增殖受到抑制,且集落形成力显著降低;过表达后呈现相反结果(图5)。另外,通过Transwell与划痕实验表明,敲除hsa_circ_0001829后抑制胃癌细胞的迁移能力,反之促进。

图5 对体外胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭影响

机制探索—由点至线,阐述完整“故事”
3. Hsa_circ_0001829作为miR-155-5p的分子海绵以调控SMAD2的表达


①锁定miR-155-5p

掌握该环状RNA的“犯罪证据”后,作者想要进一步找出犯罪路线,挖掘犯罪手法。首先作者提出疑点一,环状RNA究竟怎样促进癌细胞增殖呢?
考虑到该circRNA主要分布于细胞质中,作者从ceRNA的角度进行探究。首先利用生信分析预测并聚焦于5个miRNAs(已报道与癌症有关)可靶向hsa_circ_0001829。双荧光素酶实验发现,只有一种miRNA——miR-155-5p与hsa_circ_0001829共转染时荧光活性降低。

②miR-155-5p的靶基因SMAD2促进肿瘤的进程

在获得hsa_circ_0001829可与miR-155-5p互作“线索一”后,作者又提出疑点二,miR-155-5p的靶基因有那些呢?进一步通过生信预测miR-155-5p潜在的靶基因并进行KEGG富集分析,结果发现“癌症途径”位居第一(图6),其中SMAD2为已报道可与miR-155-5p结合。对20对胃癌与癌旁组织中SMAD2表达量检测,发现在癌组织中SMAD2显著上调。

图6 SMAD2在胃癌组织中上调表达

③通过SMAD2可促进胃癌细胞增殖

上述结果表明在胃癌进展中,hsa_circ_0001829、miR-155-5p与SMAD2可能有潜在靶向关系,接下来作者研究它们三者之间的调控关系:

  • 1) FISH检测发现hsa_circ_0001829与miR-155-5p可共定位;双荧光素酶实验表明,miR-155-5p与SMAD2结合后荧光活性显著降低;
  • 2) RT-PCR和WB显示,敲除hsa_circ_0001829后SMAD2表达均下降;同样过表达可提高SMAD2的mRNA和蛋白表达水平;
  • 3) 转染hsa_circ_0001829与miR-155-5p细胞实验表明,过表达hsa_circ_0001829对SMAD2的促进作用可被miR-155-5p抑制;同时细胞实验证实,由hsa_circ_0001829所引起的肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变,可被miR-155-5p所抑制。

以上结果表明,hsa_circ_0001829可通过结合miR-155-5p-SMAD2途径使SMAD2表达上调,以CeRNA的机制参与胃癌肿瘤进展的调控。

图7 hsa_circ_0001829通过miR-155-5p-SMAD2途径影响胃癌细胞的进展

体内模型——进一步研究体内生物学功能
4. Hsa_circ_0001829的体内生物学功能验证


以上研究均在体外进行,接下来作者为了确定hsa_circ_0001829在体内是否起到同样的调控作用,将转染sh-circRNA-1的GES-1-T细胞接种到小鼠体内。结果表明,干扰该circRNA的小鼠肿瘤体积和重量显著低于对照组;IHC实验发现敲除hsa_circ_0001829后SMAD2表达降低(图8 D)。构建肿瘤转移模型,显示敲除该circRNA后肺转移节点减少,表明敲除hsa_circ_0001829后可抑制肿瘤生长和GC恶化。

图8 干扰hsa_circ_0001829的表达抑制肿瘤的增殖和转移

全文小结

1. 机制研究:通过组学技术与qRT-PCR结合,锁定了一个真正对胃癌细胞增殖产生影响的环状RNA,位于细胞质中,可与miR-155-5p结合调节胃癌的生物学过程;
2. 研究意义:为胃癌的研究提供了新的治疗靶点,hsa_circ_0001829可能是诊断或预后的有效生物标志物,对提高胃癌患者的生存率至关重要。

『环状RNA hsa_circ_0110389促进胃癌发展机制探究』
Cell Death & Disease,IF=8.469,2021.06)


   发表杂志:Cell Death & Disease
   影响因子:8.469
   合作单位:广州医科大学附属第五医院

样本及测序方案

细胞系:GES-1(gastric epithelial cells-1,人胃上皮细胞)、胃癌细胞系(HGC-27、MKN-45、AGS、SUN-1、NCI-N87、KATO III);
组织:采集110对人胃癌组织和癌旁组织;
测序方案:对恶性转化人胃上皮细胞(GES-1-T)和NC细胞(GES-1-N)进行高通量测序。

文章思路

图9 文章思路

实验结果

1. Hsa_circ_0110389的发现及其功能探究

对GES-1-T和GES-1-N进行高通量测序,并将结果以热图展示,发现hsa_circ_0110389在GES-1-T中表达上调。对110对癌旁及癌组织进行qRT-PCR检测、生存分析,显示hsa_circ_0110389在胃癌组织中表达上调,且该环状RNA高表达的胃癌患者总存活期更短(图10)。

图10 胃癌组织和细胞中hsa_circ_0110389的表达情况

为了研究hsa_circ_0110389在胃癌中的作用,作者同样利用过表达和敲除验证。CCK-8、EdU、集落形成、伤痕实验和Transwell均表明敲除hsa_circ_0110389后对胃癌细胞增殖、迁移等有抑制作用,过表达后呈现相反趋势(图11)。表明hsa_circ_0110389可体外影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

图11 体外干扰/过表达hsa_circ_0110389对胃癌生物学功能的影响

2. Hsa_circ_0110389机制探究

①Hsa_circ_0110389可充当miRNA的分子海绵

生信分析和RNA沉淀实验表明miR-127-5p和miR-136-5p均可结合hsa_circ_0110389。双荧光素酶和FISH实验证实了该环状RNA与二者结合作用,并发现它们共定位在胞质中。推测该环状RNA可作为miR-127-5p和miR-136-5p的分子海绵。

②miR-127-5p和miR-136-5p靶基因SORT1

进一步生信预测与qRT-PCR、WB检测锁定与miR-127-5p和miR-136-5p结合的潜在的靶基因SORT1。利用RNA沉降和双荧光素酶实验进一步验证miR-127-5p/miR-136-5p与SORT1的互作,证实SOTR1是miR-127-5p和miR-136-5p的靶基因(图12)。

图12 Hsa_circ_0110389的机制研究

3. Hsa_circ_0110389可通过miR-127-5p和miR136-5p/SORT1对胃癌进程影响

①Hsa_circ_0110389通过miR-127-5p和miR-136-5p发挥功能

此部分为常规实验思路。通过CCK-8、EdU、集落形成和Transwell实验发现,转染miR-127-5p或miR-136-5p抑制剂可部分逆转干扰hsa_circ_0110389对胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移的抑制作用;而转染miR-127-5p/miR-136-5p后则呈现相反的趋势(图13)。

②通过SORT1对胃癌细胞功能影响

此部分再次通过CCK-8、EdU等实验发现过表达SORT1可逆转敲除hsa_circ_0110389引起的抑制细胞增殖、侵袭和迁移,干扰SORT1后结果相反(图13)。表明hsa_circ_0110389能够通过SORT1调控胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

图13 Hsa_circ_0110389通过SORT1对胃癌细胞表达的影响

4. 体内功能实验验证

同样,作者最后利用体内实验进一步验证hsa_circ_0110389是否能够对肿瘤发展产生影响。结果发现,干扰hsa_circ_0110389后肿瘤的重量与体积显著下降,并且炎症浸润增加、Ki67(与细胞增殖有关)的表达降低(图14)。因此,敲除hsa_circ_0110389可抑制体内GC的肿瘤生长。

图14 干扰hsa_circ_0110389可抑制体内胃癌肿瘤的生长

//  总结 //

1. 机理探究

两篇文章通过高通量测序,发现了与胃癌进程相关的circRNA分子——hsa_circ_0001829和hsa_circ_0110389。体内体外实验表明,它们对肿瘤增殖、迁移和侵袭起到促进作用。进一步的机制研究,发现:
① hsa_circ_0001829对胃癌的促进通过hsa_circ_0001829/miR-155-5p/SMAD2轴实现:hsa_circ_0001829作为ceRNA,竞争性结合miR-155-5p,使SMAD2表达水平提高,调控胃癌的进程。
② hsa_circ_0110389对胃癌的促进通过hsa_circ_0110389/miR-127-5p和miR-136-5p/SORT1轴实现:hsa_circ_0110389作为ceRNA,竞争性结合miR-127-5p和miR-136-5p,从而间接调控SORT1的表达水平。

2. 研究意义
据统计,胃癌在预后仍然很差,总体5年生存率小于30%。所谓知己知彼,方能百战不殆。该研究对环状RNA的分子机制展开全面研究,发现hsa_circ_0001829和hsa_circ_0110389有望成为胃癌预后的biomarker。若在后期临床实验进一步证实有效,将为胃癌的治疗带来福音。

▼参考文献▼
[1] Memczak, Sebastian et al. “Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.” Nature vol. 495,7441 (2013): 333-8. doi:10.1038/nature11928
[2] Hansen, Thomas B et al. “Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.” Nature vol. 495,7441 (2013): 384-8. doi:10.1038/nature11993
[3] Dykes, Iain M, and Costanza Emanueli. Transcriptional and Post-transcriptional Gene Regulation by Long Non-coding RNA. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2017, 177-186. doi:10.1016/j.gpb.2016.12.005
[4] Chen, Junwen et al. “CircRNA ciRS-7: a Novel Oncogene in Multiple Cancers.” International journal of biological sciences vol. 17,1 379-389. 1 Jan. 2021, doi:10.7150/ijbs.54292
[5] Niu Q L, Dong Z J, Liang M, et al. Circular RNA hsa_circ_0001829 promotes gastric cancer progression through miR-155-5p/SMAD2 axis[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2020, 39(1):280.
[6] Liang M, Yao W, Shi B, et al. Circular RNA hsa_circ_0110389 promotes gastric cancer progression through upregulating SORT1 via sponging miR-127-5p and miR-136-5p. Cell Death Disease. 2021 Jun 23;12(7):639.


本文作者:基迪奥-十二

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