查看: 5547|回复: 47

基迪奥客户翻译组IF=18文章再证lncRNA编码功能

[复制链接]

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
425
注册时间
2020.6.16
在线时间
273 小时

发表于 2021.9.30 14:49:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
传统ncRNA的研究多倾向于寻找分子间的互作关系,以及对mRNA的影响,但随着翻译组学研究技术的发展,现已被大量研究证明它们本身也具备编码能力。就在上周,一直致力于ncRNA生物学功能研究的中山大学陈月琴教授团队,与基迪奥合作的翻译组测序文章发表在《Molecular Cell》杂志上,功能小肽家族因此又正式迎来一名新成员,由lncRNA编码的小肽——APPLE,研究发现它能增强翻译起始过程促进造血系统恶性肿瘤的发展。本次的研究从医学临床角度来说,为靶向癌细胞翻译过程的药物开发提供了新的方向;从分子研究的角度来说,不仅阐明了一种未知小肽的功能,而且再次印证了lncRNA可编码的学术观点,是ncRNA研究取得重大进展的又一重要见证。

之前我们已为大家解读过多篇研究circRNA编码小肽的客户文章(→戳这里看原文←),下面就再来分享一下这篇由lncRNA编码的“小苹果”的鉴定之路。


合作单位:中山大学
发表时间:2021年9月22日
发表期刊:Molecular Cell
影响因子:17.970

文章摘要(太长不看版):翻译起始是翻译中的重要限速步骤,它的失调会导致癌症的发生,包括造血系统恶性肿瘤。文章利用Ribo-seq、MS、和RNA-seq在急性髓细胞白血病(AML)患者中鉴定了一种由lncRNA编码的存在于ER中的致癌小肽,APPLE。APPLE在AML的各种亚型中存在过表达,患者预后较差。分析发现小肽富集在核糖体中并调控着翻译起始步骤,增强并维持着癌蛋白高速率合成过程。从分子机制上看,APPLE促进了PABPC1-eIF4G相互作用、mRNA环化和eIF4F起始复合物组装,维持特定的促癌翻译程序。同时通过体内和体外的实验证明靶向APPLE具备抗癌的潜力。

图1 lncRNA编码小肽APPLE的研究思路

实验样本

动物模型:五周龄雄性NOD-SCID小鼠,被随机分成3组(PBS、sh-NC、sh-APPLE)用于APPLE敲低分析;或随机分成四组(PBS、NC、APPLE和APPLEmut)用于APPLE/APLLE nc 突变过表达MOLM-13细胞分析。

患者样本:患者诊断时的骨髓(BM)样本

细胞:MOLM-13、NB4、THP-1、ML-2、HL-60、MV4-11、AML患者原代细胞、HeLa、293T和COS-7。

研究结果

1. 水果摊里挑“苹果”——鉴定lncRNAs编码的小肽APPLE

通过MS和Ribo-seq对来自lncRNAs的sORFs的功能小肽进行鉴定。首先对MS鉴定到的小肽在染色体区域进行定位,然后结合这些区域内lncRNAs的Ribo-seq数据进一步确定潜在可能的lncRNA编码区域。接着,通过以下三个条件判断lncRNAs是否有编码能力:

  • 在polysome profiling中富集到;
  • 异常表达;
  • 干扰其在白血病中的表达会产生影响。

作者最终从2,828 lncRNAs中确定了12个lncRNAs具有潜在的高翻译能力,8个在髓系恶性肿瘤中有异常表达,6个在敲低后对恶性细胞增殖有显著影响,其中ASH1L-AS1敲低后对细胞生长有显著的抑制影响。

通过MS将细胞中鉴定到的小肽与ASH1L-AS1上的sORFs进行比对,推断ORF6可能翻译。这个长度273nt的ORF,能编码90个氨基酸的小肽,具有典型的起始密码子ATG和终止密码子TAG,CPC分析也发现它具有较高的编码潜能。结合融合蛋白、免疫印迹和IP质谱等实验,证实了该分析结果。并在亚细胞定位分析中发现ORF6编码的小肽主要分布在内质网(ER)中,作者将其命名为APPLE。通过对氨基酸序列分析,发现APPLE在灵长类动物中具有一定的保守性,间接证明这不是一个普通的小苹果。


图2 利用Ribo-seq和MS数据大规模筛选鉴定lncRNA编码小肽APPLE

2. 皇后的苹果,越多越不好


    ①“苹果树”超标警告——AHS1L-AS1表达量越高预后越差

为了研究小肽在癌症发展中的作用,文章先对编码APPLE的lncRNA表达模式进行了分析。通过对TCGA数据分析发现ASH1L-AS1几乎在所有癌症类型中都存在,在AML中表达最高。此外,ROC分析显示,ASH1L-AS1能区分患者和健康、CR阶段和初期诊断,具备诊断价值。

    ②“苹果”无益——APPLE能维持癌症的发展

通过体内和体外的敲低和过表达功能实验验证APPLE的作用。敲低后AML不同亚型的被测试细胞系均表现出显著的抗白血病作用,包括抑制增殖、细胞周期进程和促进细胞凋亡,克服了nb4和molm-13的细胞分化阻断和自我更新能力受损,APPLE的异位表达也能逆转敲除ASH1L-AS1的MOLM-13和NB4细胞抗癌的效应,意味着小肽APPLE具致癌活性,若靶向APPLE有潜在的抗癌作用。

使用NOD-SCID小鼠进行体内研究,发现敲除APPLE后,H&E染色看到白血病细胞浸润能力降低,肝损伤减少。血液和器官,包括脾脏和肝脏浸润能力受损与外周骨髓hCD45+细胞浸润能力的肿瘤负荷减轻变化一致,BM白血病细胞特征性分化阻滞明显缓解。综上所述,APPLE是肿瘤发生过程中关键的致癌小肽,靶向APPLE具备广谱的抗癌作用。

图3 APPLE和编码APPLE的ASH1L-AS1在AML患者中高表达

3. “苹果”的有害机制分析

    ①APPLE促进mRNA翻译

为了搞明白APPLE怎么促进AML发展的,作者用coIP分析了和APPLE相互作用的蛋白,通过GO分析发现这些蛋白的功能与翻译过程相关,并据此提出假设,APPLE通过影响翻译过程发挥作用。为了验证这个设想,作者敲除了APPLE并进行了SUnSET实验。结果发现AML细胞系中所有蛋白合成都下降了,过表达APPLE之后可以逆转。此外,敲除APPLE后,polysome profiling发生改变并且减少了polysome-to-monosome(P/M)的比率,APPLE过表达后能提升该比率。说明APPLE可以通过调控翻译起始步骤增强翻译,作者也通过添加三尖杉酯碱印证了这一点。

图4 APPLE增强mRNA翻译

    ②APPLE是PABPC1复合物新成员,增强PABPC1-eIF4G相互作用


经分析发现与APPLE互作的蛋白中,有16种蛋白和翻译相关,PABPC1与APPLE互作关系最强。实验发现RNaseA酶处理对互作关系没有任何影响,说明与RNA作用无关。此外,已有研究发现PABPC1是翻译起始过程中关键的参与者,是蛋白质合成速率限制步骤,对癌症的翻译解除很重要。PABPC1在翻译起始过程中主要步骤是通过和eIF4G相互作用介导mRNA环化。在本次实验中发现,APPLE的敲除显著降低了PABPC1-eIF4G之间的相互作用。体外的pull-downs实验进一步确认了APPLE能直接与PABPC1、eIF4G的N端domain结合。APPLE能促进PABPC1-eIF4GNt相互作用,结合亲和力以浓度依赖性的方式增加,同样说明APPLE能增强这个相互作用。


图5 APPLE能直接结合PABPC1和eIF4G促进它们的相互作用

    ③APPLE通过结合PABPC1的RRM1和RRM3结构域促进mRNA环化和翻译起始

为了进一步分析APPLE与翻译起始过程间的关系,作者进一步剖析了APPLE与关键蛋白之间的互作关系。之前有研究发现eIF4G能直接和PABPC1的RRM2结构域结合,后续研究发现RRM1或RRM3对它们的结合有更大的影响。在此次实验中证实,敲除RRM1或RRM3之后会影响PABPC1-APPLE之间的互作,二者均敲除会使互作关系完全消除,所以作者推测APPLE使PABPC1-eIF4G复合物成员之一,作为铆钉结合rrm1和rrm3增强它们之间的相互作用。

接着,作者用MS2 tehtering评估APPLE对mRNA环化的影响。结果发现当报告mRNA的3’UTR与APPLE相连时翻译效率(TE)会升高,说明APPLE促进了mRNA环化(这种环化能促进终止核糖体与同一mrna分子进行新一轮的翻译,从而增强了蛋白质的合成),并通过m7G的pull-down等实验验证了APPLE参与到了eIF4F复合物组装过程。以上数据说明APPLE在翻译促进过程发挥着自己的作用,作为一种新的翻译起始复合物成分促进mRNA环化和eIF4F组装。

图6 PABPC1有多个结构域,APPLE通过RRM1和RRM3发挥作用

    ④APPLE调控一类mRNAs的翻译促进AML发展

癌症的翻译过程是很复杂的,翻译结构成分的变化会在癌症进程中改变mRNAs的翻译,所以作者对APPLE调控的mRNAs特异性子集进行了研究,进一步探究APPLE是如何“翻译”AML的。作者对MOLM-13细胞和敲除APPLE后的MOLM-13细胞进行Ribosome profiling(Ribo-seq)。14,099转录本存在三碱基周期,并且大部分的reads来自CDS区域,说明成功富集了翻译中核糖体结合的reads。为了说明RPF丰度的变化是否来自mRNA水平的改变,作者同时结合了RNA-seq数据分析了敲除APPLE后mRNAs子集的TE变化,找到626个TE发生下调的基因。

这些基因在翻译起始的区域read分布显著增加,说明APPLE促进了这些基因的翻译起始过程。通过GO分析发现这些基因主要参与到了细胞分化、生长、死亡,这些对肿瘤的发展都很重要,说明APPLE起到关键的促癌作用。为了验证这一点,文章挑选了几个与细胞生存相关的基因绘制了翻译组和转录组reads分布的图形,发现APPLE敲除后主要影响的是翻译过程,对转录过程无显著影响。后续又通过MOLM-13和原发性患者细胞的对比,多聚体/亚聚体比率的分析证实了结果。

图7 APPLE调控特定mRNA翻译过程促进癌症发展

小结

1. 机制研究:
文章利用MS、Ribo-seq、RNA-seq数据,和一系列的分子实验鉴定了一个真正的lncRNA来源的功能小肽——APPLE,位于ER中,作为翻译机制的重要成分刺激PABPC1-eIF4G相互作用以促进翻译起始,最终促成癌症的发生。发现新的小肽并破译其生理功能将有助于更深入了解小肽的多样性和复杂性。
‍‍‍‍‍‍‍‍
‍‍‍‍‍‍‍‍图8 APPLE作用机制示意图

2. 临床应用:
长期以来,AML以其复杂的异质性而闻名,包括基因组和表观遗传异常,一些翻译相关的药物在AML特殊亚型中已有应用。此次发现的小肽APPLE在AML各种亚型中均高表达,可成为应用更广泛的预后因子。本次发现的小肽结构简单,也更有可能成为PPI抑制剂靶向治疗的药物。相信小肽在更多的癌症中,会得到更广泛的应用。

基迪奥提供的Ribo-seq服务,除了上述lncRNA编码小肽的研究内容,还有如下丰富的分析方案,欢迎前来咨询,总有一款适合你~

图9 基迪奥翻译组学研究内容


本文作者:基迪奥-萌神


本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.4 11:08:35 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.4 21:03:04 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.5 08:20:09 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.5 11:27:40 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2021.8.19
在线时间
2 小时

发表于 2021.10.5 19:00:04 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.6 08:07:45 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.6 21:35:55 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.7 08:29:46 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.7 22:08:17 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

中华鲟

Rank: 5Rank: 5

主题
0
注册时间
2020.2.12
在线时间
75 小时

发表于 2021.10.8 08:08:40 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.8 08:33:32 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2017.6.6
在线时间
140 小时

灌水之王


发表于 2021.10.8 08:44:17 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.22 16:04:46 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

中华鲟

Rank: 5Rank: 5

主题
1
注册时间
2016.8.25
在线时间
89 小时

发表于 2021.10.22 23:05:44 | 显示全部楼层
当工人也要加油
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.23 19:30:44 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.23 21:47:46 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
68 小时

发表于 2021.10.24 11:08:00 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
71 小时

发表于 2021.10.24 21:09:47 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2017.6.6
在线时间
140 小时

灌水之王


发表于 2021.10.25 08:19:11 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表