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基迪奥10X单细胞技术助力病毒-宿主免疫关系研究

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发表于 2021.7.1 10:24:15 | 显示全部楼层 |阅读模式

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今年新型冠状病毒疫情引起全球关注,其中病毒所引发的宿主免疫应答是病毒防治的重要课题之一。宿主为了防御病原体入侵,会产生一系列免疫反应来应对病原体感染。宿主免疫反应在防御病原体和消除病原体的过程中起着积极作用;但是,由病原体引起的过激的炎症反应也会对宿主本身的器官机能造成负荷和损伤,并可能进一步引起死亡。所以,研究宿主免疫对建立完善合理的医学治疗方案有重要的引导作用。

单细胞转录组为病原体与宿主间互作研究提供了更直观的视角,它能更好回答病原体入侵了哪类细胞、哪类细胞对病原体做出了反应、宿主产生了什么免疫机制等问题。自疫情爆发以来,单细胞技术已经被广泛应用在病毒与宿主免疫应答的研究当中[1][2][3]

今天我们要分享的是一篇发表在《PLoS Pathongens》上的基迪奥生物合作客户文章。文章以单细胞转录组技术为主要研究手段,深入探讨了甲型流感病毒与宿主免疫应答之间的关系[4]。其研究思路在我们近期的病原宿主研究中尤其值得参考。


合作单位:中山大学
发表期刊:PLoS Pathogens
影响因子:6.463

研究背景

甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)是一类季节性和感染性很强的病毒,使宿主发生严重的肺炎并发脏器衰竭而导致病死率较高。由IAV引起的异常的肺部炎症反应,既是宿主对病毒的防御机制,也是肺部炎性损伤的主要来源。那么,在IAV入侵期间,肺部免疫细胞群体的炎性因子分泌特征和肺泡巨噬细胞的稳态维持机制一直没有得到良好的解决。

研究材料

使用H1N1病毒感染小鼠,在感染后1、3、5、7、12天取小鼠肺制备单细胞悬液,另取未感染病毒的小鼠肺制备单细胞悬液,用于单细胞转录组测序。

研究思路


图1 文章研究思路

结果解读

1、病毒感染细胞群体鉴定

单细胞转录组在建库时是捕获的细胞内带有poly(A)的RNA,所以,对于在胞内存在转录翻译的病毒而言,具有poly(A)结构的病毒mRNA同样被捕获。基于IAV的转录本特征,作者获得的单细胞转录组数据中同样包含了病毒的转录本信息。

作者首先将各个时间点的细胞进行了聚类分群,并根据基因表达特征将所有细胞划分为单核细胞系、淋巴细胞系、粒细胞系和红细胞系四类细胞,并通过检测病毒基因的表达,发现病毒主要感染单核细胞系和粒细胞系,而这两类细胞也是后文描述的产生炎性因子的主要细胞群体。病毒对肺部的感染特征在这一部分得到了初步的描述。

图2 A) 细胞亚群tSNE映射图;B) 病毒基因在各个细胞亚群的表达分布小提琴图

2、炎性因子存在第1天和第7天两次高表达

前文描述了病毒主要侵染的细胞群体,但是数目众多,且功能不详。作者接下来针对炎性因子表达特征绘制了热图,并发现炎性因子在第1天和第7天各出现了一次表达高峰。第一次高峰涉及Ccl3、Ccl4、TNF-α、IL1α等炎性因子的表达,而且炎性因子的表达集中在粒细胞系的第13亚群(C13)中;第二次高峰涉及Ccl7、Ccl8、Cxcl10、C1q等炎性因子的表达,而且炎性因子的表达集中在单核细胞系的第8亚群(C8)中。后续,作者针对C13和C8两个亚群做了更细致的分析。

图3 基因表达热图。A) 验证因子在不同时间点表达情况;B) 第一次炎性因子高峰的炎性因子在各个亚群表达情况;C) 第二次炎性因子高峰的炎性因子在各个亚群表达情况

3、PD-L1+中性粒细胞在第一次炎症高峰发挥主要作用

特征基因功能是一个细胞亚群功能的最直观体现。作者对C13的特征基因进行了GO富集分析,特征基因富集到促炎反应途径和中性粒细胞趋化性相关途径。这一结果既验证了C13在第一次验证高峰的主要地位,也说明了C13是中性粒细胞的可能性。通过皮尔森相关系数分析,C13与作为经典中性粒细胞的C14和C16具有很高的相似性。所以作者将C13定义为中性粒细胞。

与相似度较高的C14和C16相比,C13的PD-L1表达量明显较高,所以,作者以PD-L1作为C13的标记基因进行细胞实验验证,流式结果显示病毒感染后PD-L1+中性粒细胞比例明显增加;免疫荧光结果显示有病毒侵染的中性粒细胞几乎都有PD-L1的表达。

作者综合单细胞转录组数据和细胞实验结果认为PD-L1+中性粒细胞在第一次炎性因子表达高峰中发挥着主要作用。

图4 A) C13亚群特征基因的GO富集分析;B) 以炎症反应和病毒防御通路进行的亚群间相关性分析;C) PD-L1在各亚群基因表达小提琴图;D) 病毒分布和PD-L1的表达分布免疫荧光结果

4、Pf4+巨噬细胞在第二次炎症高峰发挥主要作用

与C13的研究思路相似,通过炎症因子的富集和皮尔森相关性分析,C8被认定为巨噬细胞。同时,Pf4基因于C8中呈现高表达状态而被作为C8标记基因。

此外,Pparg和Tgfb1这两个基因在C8的高表达引起了作者的注意,Pparg是肺泡巨噬细胞成熟的必须转录因子,TGF-β是单核细胞源肺泡巨噬细胞成熟的主要细胞因子。这预示着Pf4+巨噬细胞可能是肺泡巨噬细胞的前体细胞。

为了验证以上结果,作者构建了Pf4-cre:iDTR条件敲除鼠。在Pf4敲除的小鼠中,炎性因子的分泌显著下降,肺泡巨噬细胞的数量也明显减少。

图5 A) 各亚群相关性分析;B) Tgfb1在各时间点表达小提琴图;C) Pparg在各时间点及各样本表达小提琴图;D) Pf4在各个亚群表达小提琴图;E) 敲除Pf4后TGF-β的表达情况;F) 敲除Pf4后肺泡巨噬细胞流式分析结果。

5、两次验证高峰的受体配对分析

炎性因子的分泌构成了宿主免疫调控系统中的重要信号网络。作者基于受体-配体配对信息绘制了各个细胞亚群炎性因子的配对关系网络。

IL1家族的炎症因子在C13亚群中表达量较高,相对的,IL1受体IL1R2、IL1RAP在C13、C16和C10中表达量较高。除此以外,前文未发掘出的M1巨噬细胞、NK细胞也分泌配体调节C13的炎症反应。

在第二次炎性因子高峰中,Ccl2/Ccr2和Ccr5配对在细胞亚群间是最普遍的。C8和肺泡巨噬细胞的受体-配体配对关系也是非常紧密的,这在一定程度上印证了Pf4+巨噬细胞和肺泡巨噬细胞具有的潜在关联关系。


图6 C13(A和B)和C8(C和D)的受体-配体配对分析

总结

本文借助单细胞转录组技术描述了IAV感染期间肺部免疫细胞群体两次炎性因子分泌高峰及其主要细胞类型,并给予了足够的细胞实验和分子实验验证。从这篇文章我们可以看出单细胞转录组在宿主免疫研究中的独特视角,可以帮助确立效应细胞群体和它的潜在功能特征,也有利于解析免疫系统中的复杂免疫调控网络。

这篇文章为我们提供了一个有效的以基因表达特征为切入点的研究思路——以病毒的基因表达特征研究主要侵染细胞,以炎性因子的表达模式反应样本炎症状态,以炎性因子的表达分布探索主要效应细胞,最后以炎性因子的受体-配体配对情况解析复杂免疫调控网络关系。这种思路对于具有poly(A)尾的病毒研究来说都是普遍有效的。同时也适合推广于其他胞内营胞内寄生的病原体,为更多的病原体防治工作提供方案建议。

病原体一直是危害公众健康安全的重要因素,单细胞测序技术为研究病原体入侵途径和宿主响应机制提供了全新、快捷的解释途径。除了本片文章描述的甲流病毒引起的宿主免疫机制外,今年单细胞转录组技术就还为描述新冠病毒以ACE2蛋白为靶点的广泛靶细胞特征提供了组学基础,为研究弓形虫速殖子抗原表位提供了分析基础。

现今单细胞转录组技术在病原防治领域的应用也让我们看到了该技术未来在生命科学及医疗界得到更多领域应用的广大前景;nature method也将单细胞多组学列为2019年年度技术。在未来的多年内,单细胞测序技术依然会为解决更多生物学问题提供平台。基迪奥如今积累了丰富的单细胞项目经验,我们建立的单细胞转录组分析平台也为广大客户提供了一个简单好用的自主分析平台,相信我们的单细胞测序服务会为有需求的老师提供更优质的组学分析体验。

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参考文献:
[1] Zhang H, Kang Z, Gong H and et al. The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes. bioRxiv, 2020.
[2] Wang J, Zhao S, Liu M and et al. ACE2 expression by colonic epithelial cells is associated with viral infection, immunity and energy metabolism. medRxiv, 2020.
[3] Xu D, Zhang H, Gong H and et al. Identification of a potential mechanism of acute kidney injury during the COVID-19 outbreak: a study based on single-cell transcriptome analysis. Preprints, 2020.
[4] Zhang J, Liu J, Yuan Y and et al. Two waves of pro-inflammatory factors are released during the influenza A virus (IAV)-driven pulmonary immunopathogenesis. [J] PLoS Pathog, 2020. 16(2):e1008334.


本文作者:基迪奥-L.L

来源: 基迪奥10X单细胞技术助力病毒-宿主免疫关系研究
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