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转录+蛋白+代谢,解析心衰小鼠能量代谢过程的调控机理

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迅猛龙

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发表于 2021.4.30 09:27:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.4.30 09:26 编辑

作为mRNA下游产物——蛋白质,常常被用于对转录组测序的补充或者转录组结果的验证。转录+蛋白的关联分析也是组学案例文章中的常用“套路”。在之前的微信文章中,我们介绍过很多“转录+蛋白”的高分文章(往期文章:“详解“冬日甜心”的转录与蛋白关联分析TOP 期刊文章”)以及关联分析时的常用图形(往期文章:九象限图应用及绘制),今天就和大家再分享一篇转录与蛋白关联分析的案例,用实际案例展示用组学关联的思路挖掘重要调控通路。当然文章用了代谢组作为补充,但在关联分析思路中还是以“转录+蛋白”为主。


发表期刊:International Journal of Biological Sciences
影响因子:4.858
发表时间:2020年10月
合作单位:天津中医药大学第一附属医院

研究背景

心力衰竭(HF)是部分心血管疾病共有的慢性过程。能量缺乏和心肌能量代谢障碍是心力衰竭的主要症状,Shen-Fu(S-F)是由人参和乌头提取物组成的中药专利制剂,先前研究表明S-F能显著改善横主动脉缩窄(TAC)所致心衰小鼠的心脏功能,减轻心室重构,而其内在的分子调控机理仍不清晰。本文中,作者将通过转录组、蛋白质组、代谢组并结合组织病理学、血流动力学等,阐明S-F对TAC诱导的心力衰竭(HF)小鼠能量代谢的作用机制。

研究方法

成年雄性C57小鼠,通过手术处理将小鼠分为:
假手术组(CK、仅做手术,心脏组动脉未收缩);
TAC组(手术处理并进行心脏主动脉缩窄);
缬沙坦组(主动脉缩窄后,用缬沙坦治疗);
2.5gS-F组(主动脉缩窄后,用2.5g计量S-F治疗);
5gS-F组(主动脉缩窄后,用5g计量的S-F治疗);
10gS-F组(主动脉缩窄后,用10g计量的S-F治疗)

用CK组、TAC组、10g S-F组小鼠心脏组织进行转录组测序、蛋白质组和代谢组检测。

研究思路


研究结果

1.生理表型测定,观测形态变化

了解过转录组的小伙伴应该都清楚,广义上的转录组测序是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA总和,该定义明确了转录组研究存在一定的时空特异性。因此,取样时间、样本状态、样本类型可能对我们的研究结果起决定性作用,如何从选取最佳时期样本并降低整体的实验成本,生理表型测定尤为重要,其价值主要体现在:

1)对于需构建模型的研究,可帮助我们判断模型构建是否成功;

2)通过连续不断的表型观测,可辅助我们选择最佳拐点样本,降低测序成本;


3)基因调控的最终结果是作用于代谢物,并以生理表型性状展现,基于表型变化可验证转录组数据的准确性或者挖掘的功能基因是否准确
(常用于通过转录组筛选到候选功能基因后,通过基因敲除或者过表达等实验验证候选功能基因的准确性);

4)丰富文章内容,使文章更饱满更完整。生理观测+测序+生信分析+验证。

测序前期,作者对各组小鼠心脏的体积、重量、心脏收缩和舒张功能、血液动力学进行测定,发现S-F可显著抑制TAC引起的心脏收缩和舒张功能障碍、心肌肥厚和心室重构。通过对心肌细胞结构、面积、血浆心肌细胞外基质因子(MMP)水平、心肌纤维化等指标进行观测,发现S-F可降低TAC引起的心肌组织坏死、心肌纤维化、心肌肥厚程度。同时,S-F治疗可提高耗氧率(OCR)、增强心肌线粒体的结构和功能完整性。

图1 生理指标测定:心脏重量/胫骨长度、肺重量/体重等

2.单组学独立分析,获得关键代谢通路

了解表型现象的内在调控机制的有效手段大多还是在组学检测上,通过基因组了解编码信息、转录组探究基因转录情况、翻译组获取转录本翻译效率、蛋白质组检测氨基酸类型和丰度变化、代谢组揭示代谢物轮廓信息及丰度变化。作者在测序阶段,选取CK组、TAC组、10gS-F治疗组进行转录组、蛋白质组、代谢组检测以全面了解S-F调控的复杂机制。测序部分初始,作者先对三组学检测结果分别进行差异分析,获得TAC、S-F处理下基因、蛋白质、代谢物的变化规律,并获得差异变化的物质主要富集在哪些通路中

转录组结果提示:相比于CK组,TAC处理后有724个基因差异表达;相比于TAC组,S-F组中有92个基因显著下调,18个基因显著上调,说明用S-F处理后,有110差异表达基因得到恢复;蛋白质组提示,共获得421个差异表达蛋白。相比于TAC组,S-F组中有29个蛋白上调表达,35个蛋白下调表达;代谢组共检测出721种差异表达代谢物,经S-F处理后,有336种代谢物下调,117种代谢物上调。

差异基因和差异蛋白的KEGG富集分析显示:两组学的差异物质显著富集在能量代谢过程(图3A、B),例如:脂肪酸代谢、碳水化合物代谢。两组学趋势分析结果提示,显著富集趋势的差异基因和蛋白质也是集中在能量代谢过程(图3C、D)。两种分析结果共同暗示S-F治疗可显著调节心衰小鼠的能量调节过程

图2 A~C:转录组差异分析结果;D~F:蛋白质组差异分析结果;G~I:代谢组OPLS-DA分析和差异分析结果

图3 A、C差异基因KEGG富集和趋势分析;B、D差异蛋白KEGG富集和趋势分析

3.组学关联分析,锁定目标代谢通路

由上述可知,单组学结果共同指向能量代谢通路,然而能量代谢相关通路中又涉及很多KEGG B class。‍‍‍在众多B class中进一步缩小通路范围,才有利于我们更深入的阐释基因和蛋白参与的调控机制。在实际项目中,我们也经常面临,显著富集到的通路很多,如何从这些通路中进一步锁定目标通路的难题。此时,给大家的建议主要有以下三点:

①基于先前学者研究结论:
通过大量文献,检索与自己研究领域、研究机制相同或相似的文章,收集他们的研究结果并在自己的数据中进行查询,查看是否有类似的结果。如:您研究花朵的颜色变化,在别人研究中发现花朵颜色变化与花青素合成通路有关,此时您可在自己富集通路中查找是否有花青素合成通路,再对通路中的基因进行讨论;

②基于通路显著性和富集的数量:
当通过文献检索不到有用信息时,建议大家先选择富集的基因数或蛋白质比较多的通路,因为最显著富集的通路往往显著性高,但富集的基因数量少,有时在其中难以提取有用信息,而对于富集数量多的通路,选择性多,从中获取有用信息的可能性也比较大;

③基于组学的关联策略:
该策略主要基于基因、蛋白质、代谢产物的丰度变化信息,查看两组学中共同高丰度或低丰度表达的物质,研究他们共同富集到的通路;或者与某一过程相关的基因、蛋白质等,查看共同富集的通路信息,两组学结果相互补充,相互验证。文章作者也是采用这种方式,缩小目标通路。

作者先将差异基因和差异蛋白关联分析,九象限图显示:TAC处理后,有3,418个基因在转录和蛋白层面发生变化,其中有96个共同上调,200个共同下调。经S-F处理后,有63个基因在蛋白丰度和转录状态上存在显著差异。进一步在两组学中检索与能量代谢有关的差异基因和蛋白质,发现他们主要参与脂肪酸代谢、丙酮酸代谢、葡萄糖代谢过程(图4E、F)。同时利用涉及能量代谢通路的68个mRNA和蛋白质,根据两者间的联通数量绘制相互作用网络图,发现他们显著富集在脂肪酸和葡萄糖代谢、AMP活化蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路(图4G、H)。

代谢组结果提示,脂肪酸代谢途径中,与能量相关的代谢物:戊二酸、亚油酸、(9Z)-十八烯酸等物质发生显著变化;AMPK通路中的AMP和D-果糖-6-磷酸等也发生显著变化。同时差异代谢物的趋势分析提示,显著富集趋势中的差异代谢物主要与能量代谢有关(图5)。证实S-F治疗可在转录、蛋白、代谢水平对心衰(HF)小鼠的能量代谢产生协同效应,脂肪酸代谢和葡萄糖代谢是被S-F治疗显著影响的代谢途径。对通路中涉及到的基因和蛋白进行免疫印记和18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose)验证,证实转录组、蛋白质组结果准确。

图4 E:TAG处理后基因和蛋白九象限图;F:S-F处理后基因和蛋白九象限图;G:与能量相关的mRNA和蛋白互作网络图(点的大小代表关联的数量);H:与能量代谢相关的差异基因、蛋白KEGG富集

图5 差异代谢物趋势分析

小结

文章整体思路很清晰,先从生理指标入手发现S-F处理可改善由TAC引发的心衰小鼠心肌收缩和舒张功能,减轻心肌组织坏死、心肌纤维化和心肌肥厚等症状,同时提高耗氧率(OCR),增强心肌线粒体的结构和功能完整性。之后通过各组学独立分析发现S-F处理后,小鼠心肌组织能量代谢过程得到改善,再根据能量代谢相关差异基因、蛋白、代谢物进一步将范围缩小至脂肪酸代谢过程、葡萄糖代谢过程,并挑选重要的转录因子、蛋白激酶等进行验证,证实组学结果的可靠性,为S-F介导的心衰小鼠能量代谢重塑过程的调节机制,以及重要基因和代谢物进行探讨。

文章整体内容比较丰富:表型+转录+蛋白+代谢,从多角度多层次上阐释生物学问题。组学间的不断验证再加上后续的验证性实验,有理有据,使整个文章结论的可信度增加一个层级。大家在写自己的文章时,也可以参考该文章的写法,用组学结果相互补充,相互验证~

今天的案例分享就到这里啦~想了解更多组学关联思路,可持续关注我们~

本文作者:基迪奥-zero      


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