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常规的转录组+代谢组“套路”也能发出6+文章

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迅猛龙

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发表于 2021.4.6 14:08:37 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.4.6 17:05 编辑

基于转录组测序,从基因层面通过差异分析和富集分析等锁定关键基因,揭示表型现象的内在调控分子机制,这一方法已成为科学研究中的“套路性”研究思路,尤其是随着测序成本的不断降低和技术不断成熟,无论有/无参考基因组,很多物种都可以转录组测序方式,挖掘一些差异表达的基因。然而,由于基因与表型难以直接关联,在实际项目中,有时仅通过转录组测序结果,难以帮我们锁定关键信号通路,因此往往达不到预期研究目的。尤其是当我们通过查阅文献找不到目标基因或者富集通路,同时又难以将转录组数据与表型性状结合在一起时,总是会觉得缺少一个步骤。于是,大家逐渐将目光转向与表型连接最为紧密的代谢组,有了代谢组学的“加持”,通过转录组+代谢组的研究策略,可为我们挖掘重要代谢相关功能基因提供一个有效、快捷手段。

常规的转录组与代谢组的关联分析,是基于“参与同一生物过程中的基因或代谢物具有相同或相似的变化规律”开展的。通过代谢物检测,发现某类代谢物在不同样本中含量差异显著(比如A物质),或者差异代谢物主要富集的通路;之后进行转录组测序,在众多差异基因及代谢通路中,重点研究与物质A合成相关的代谢通路上的基因,从而可以快速找到导致样本表型出现差异的重要功能基因。同时,两组学可互相验证,彼此补充。

今天就用实际案例,带大家了解下如何用常规的关联套路,发出高分文章~


发表期刊 :
Genomics
影响因子:6.205
发表时间:2020年10月
合作单位:中国农业科学院果树研究所

研究背景:

梨是中国的第三大经济水果,中国梨的产量占全球第一。根据栽培品种不同,梨可分为欧洲梨、新疆梨、沙梨、白梨和乌苏里梨。不同于白梨在采摘后可立即食用,乌苏里梨在采摘后需经过一段时间的储存,使其果实变软后才可食用。先前研究表明,脂肪酸组成是水果果实软化过程的重要调节剂,植物激素信号、淀粉转化成单糖的过程和风味化合物积累等过程均会影响果实的成熟,但脂质变化对梨软化过程的调节作用知之甚少。本文利用乌苏里梨品种中的早树李珊梨(ZSSL)为材料,用转录组、代谢组技术全面解析梨采摘之后的软化机制。

研究方法:

①采摘后,未经储存的梨为对照组(ZSSL0d);
②采摘后,后置于25℃环境下储存18天直至其变软的梨为实验组(ZSSL18d);

取果肉组织速冻后,-80℃存储用于后续的RNA-seq测序和UHPLC-QTOF-MS检测。每组3次重复,共6个样品。

技术路线图:


研究结果:

1.代谢组学揭示果实软化前后代谢产物变化

从与表型相关最密切的代谢组学入手,筛选关键代谢物,在锁定目标物质的同时,可为转录组中关键通路的筛选提供理论基础和参考,协助筛选关键基因,也可提升候选基因的准确性和区分候选基因的重要性。

作者对质谱得到的原始数据,开展生信分析。PCA分析显示,两组样品中代谢物含量被明显分离,说明第0天和第18天的样品中代谢物含量的不同,与观察到的果实随时间的推移整体软化的差异一致(图1)。对两组代谢物进行差异分析,发现与ZSSL0d相比,ZSSL18d的样本中共有98个代谢物上调表达,95个代谢物下调表达,其中磷脂酰甘油(17:0/14:1(9Z))含量是ZSSL0d的6倍,15-甲基十六烷酸甲酯是ZSSL0d的5倍。差异代谢物KEGG富集分析结果提示,显著富集的通路有甘油磷脂代谢过程、糖基磷脂酰肌醇(GPI-anchor)生物合成过程,暗示这两个过程是促进果实软化的重要调节通路。对两个通路的进一步分析发现,PC(14:0/22:6)、PE(14:0/22:5)、PE(18:3/18:2)主要参与甘油磷脂的合成,PE(16,0/18:2)、PE(18,3/16:0)、PE(22,2/18:4)主要参与GPI-anchor合成通路(图2)。

图1 样品代谢物PCA分析

图2 差异代谢物KEGG富集圈图(A)与热图(B)

Tip:
脂质物质命名时常用物质名称的缩写加上分子结构信息。如:PC(14:1/22:2)中,
PC:磷脂酰胆碱;
(14:1/22:2):该物质有两条碳链,其中一条链有14个碳原子,且在这条链上有一个不饱和双键,另一条碳链上有22个碳原子,且在这条链上有2个不饱和双键。14:1书写在前,表示含有14个碳原子的链为主链,另一条链为侧链。

2.转录组筛选参与果实软化的候选基因

从转录组层面揭示分子调控机制,分析经外界环境变化,或处理效应导致的样本中基因表达量的变化,再通过对差异分析获取差异基因,并对差异基因进行富集分析,逐步筛选调控目的表型特征的关键基因是转录组类型文章的常用思维。根据转录组的富集结果不仅可以寻找关键调控通路,与其他组学关联分析时,也可作为其他组学富集分析的补充

转录组数据差异分析提示,共鉴定到6,496个差异基因,其中1,100个上调表达,5,936个下调表达。差异基因主要富集的关键通路有“碳水化合物代谢”、“氨基酸代谢”、“脂质代谢”、“翻译”过程,同时有210个与脂质相关的基因在两组中差异表达,其中ZSSL18d 中GPAT1的表达量是ZSSL0d的8倍,HHT1含量是ZSSL0d的10倍。差异基因富集分析同时提示主要富集的通路有“甘油磷脂代谢”、“真核生物中核糖体生物发生”、“脂肪酸降解”途径(图3)。

先前研究表明,脂肪酸组成与果实成熟过程中的硬度有关,因此作者把目光集中在与脂质代谢有关的代谢过程中,发现“甘油磷脂代谢”过程与脂质代谢有关,而且在此通路中YLR118C、NPC1、GPAT1、NPC3和GDPD2在两组中均差异表达,提示这些参与脂质代谢的基因可能是调控果实软化的候选基因。

图3 差异基因KEGG富集圈图(A)与热图(B)

3.组学关联分析,锁定关键通路和关键基因

转录组与代谢组关联分析,通过代谢通路图或网络图可直观展示内在的调控机制。

由于差异代谢物和差异基因均显著富集到“甘油磷脂代谢过程”,同时该通路与脂质代谢有关,因此对该通路中的代谢物和基因详细解析。代谢组数据提示,在梨的储存过程中,PC(14:1/22:2),PC(16:0/22:6),PC(18:1(11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)),PC(18:2(9Z,12Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))4种物质的含量在逐渐增加,同时间段内PE(16:0/18:2),PE(14:0/22:5),PE(18:3/18:2)的含量有所降低,而转录组中参与甘油磷脂代谢的基因:GDPD2(甘油磷酸二酯酶)、GPAT(甘油-3-磷酸乙酰转移酶)、PLDDELTA在储存过程中上调表达,而YLR118C,PLMT下调表达,此结果与代谢组的结果一致,证实在梨采摘后,“甘油磷脂代谢”过程与软化过程密切相关。

基于甘油磷脂代谢过程,利用与该通路有关的差异基因和差异代谢物,计算两者的皮尔森相关系数。结果提示:PC(18:1(11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))与CCT2(胆碱-磷酸胞苷酰基转移酶1)和LCAT3(磷脂酶A)之间显著负相关;PE(18:2/18:3)与NPC1之间显著负相关;PE(14:0/22:5)与AST1(甘油-3-磷酸酰基转移酶)和LCAT4(卵磷脂-胆固醇酰基转移酶)之间显著正相关。提示这些基因表达量发生变化时,可能引起相应的代谢物含量发生变化,为今后全面了解这些相关关系的调控机制提供理论基础。

图4 甘油磷脂代谢通路中差异基因与差异代谢物相关性网络图

小结

不难发现,整篇文章没有过多的实验内容和较难的复杂分析,作者通过代谢组的常规分析点锁定关键代谢物和富集通路,之后通过转录组结果获取关键基因和关键通路,将两组学数据整合,再结合先前的研究结果锁定目标通路。在此基础上,基于目标通路中的基因或者与目标通路有关联的代谢物和基因,利用相关性绘制两者之间的网络图,同时为后续全面研究“甘油磷脂代谢”过程对梨软化机制的影响。

在本文转录组数据分析部分,作者使用了差异分析、富集分析等方式挖掘重要通路和关键的基因和代谢物。基迪奥开发的Omicsmart 转录组在线报告也可帮助大家实现利用图标交互动态模式挖掘测序重要数据,可自定义分析阈值,可在线调整图形样式,满足您的研究和发文需要,直接在OM商城中下单,即可体验

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基迪奥生物多年专注于表观遗传修饰领域,为广大客户提供优质的DNA/RNA甲基化测序服务以及转录组测序服务,更有定制化多组学关联分析方案,助力客户发表高分文章。

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参考文献:
Xu J, Zhang Y, Qi D, Huo H, Dong X, Tian L, Liu C, Cao Y. Metabolomic and transcriptomic analyses highlight the influence of lipid changes on the post-harvest softening of Pyrus ussurian Max. 'Zaoshu Shanli'. Genomics. 2021 Jan;113(1 Pt 2):919-926.

本文作者:基迪奥-zero

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发表于 2021.4.7 13:22:20 | 显示全部楼层
差异基因表达量差异不大,但是倍数改变大,是怎么回事。
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 楼主| 发表于 2021.4.8 11:34:11 | 显示全部楼层
胡雪丽 发表于 2021.4.7 13:22
差异基因表达量差异不大,但是倍数改变大,是怎么回事。

转作者大大回复:
这个一般是低丰度表达的基因会出现这种情况。低丰度基因定量通常不准,同时又易受到测序波动影响,只要测序背景稍微变化,差异倍数就会相差很多
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