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全面且详细的GSEA富集分析图形解读及案例应用

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迅猛龙

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发表于 2020.12.21 09:26:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2020.12.21 09:26 编辑

GSEA富集分析弥补了传统富集分析问题,它可以不经过差异基因筛选,从而保留一些被差异基因筛选掉的关键信息,进而找到那些差异不显著但基因差异趋势很一致的功能基因集。

由于GSEA富集分析方法操作简单,这里不展开详细介绍。如果您不会GSEA富集分析原理及操作,可以前往OmicShare在线课堂查找相关课程学习,

课程链接:
https://www.omicshare.com/class/home/index/search?key=gsea

以及由基迪奥开发的网页版的GSEA分析工具(该工具方便简单,可对结果图形进行个性化调整)。网页版GSEA工具操作具体介绍参见《OmicShare平台又有大动作了!新一波分析绘图工具来袭》。工具链接如下:

GSEA静态工具:
https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gsea

GSEA动态工具:

https://www.omicshare.com/tools/home/report/report_gsea.html

敲重点!!!敲重点!!!敲重点!!!

我们今天分享的主要内容是:
1.为初学者详细解读GSEA富集分析的结果图形;
2.结果图形能够说明的生物学问题;
3.案例展示及应用。

常见的GSEA富集分析的结果图形有3种类型,分别为如图1所示的标准GSEA富集分析图形;图2所示GSEA富集总的结果图形;图3所示的GSEA富集分析结果点阵图(可以说是最全面的GSEA图形详解了)。

图1 标准GSEA分析结果图形

图2 对GESA分析结果整合的总结果图形(GO分析结果)

图3 GSEA富集分析结果点阵图

这些图形如果放在文章中是不是瞬间提升了文章档次呢?下面给您分别详细解读。

标准GSEA富集分析图形

该图形是GSEA分析的标准图形,如图4所示,它分为3部分(红色边框),上面部分表示ES累加过程中的增减变化曲线;中间部分表示目标基因集成员(黑色竖线)在所有基因排序中的位置;下面部分表示按指标从高到低排序的基因,指标的真实值(可以理解为差异倍数的log2值)。

图中我们一般关注ES值,峰出现在前端还是后端(ES值大于0在前端,小于0在后端)以及Leading-edge subset(即对富集贡献最大的部分);在ES图中出现领头亚集的形状(红色虚线前),表明这个功能基因集在某处理条件下具有更显著的生物学意义。对于分析结果中,我们一般认为|NES|>1,NOM p-val<0.05,FDR q-val<0.25的通路下的基因集合是有意义的。

绘制图4所示的图形需要先用GSEA软件绘制出标准图形,再用R包进行修饰。当然也可以用文章开头的网页版工具绘制GSEA标准图形:

GSEA静态工具:
https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gsea

GSEA动态工具:

https://www.omicshare.com/tools/home/report/report_gsea.html

图4 用R包对标准GSEA分析结果图形美化后的结果图形

标准GSEA分析图形在文章中应用最多,下面给大家展示两篇基迪奥客户文章中应用的GSEA分析图形

案例一:RNA-seq揭示DEHP睾丸损伤机制[1]


目的:邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一种广泛使用的增塑剂,长期以来被认为是一种内分泌干扰化学物质,具有男性生殖毒性,在青春期前暴露于DEHP可能导致广泛的睾丸损伤,然而,其潜在的损伤机制尚不清楚。本文旨在利用RNA-seq技术在小鼠模型中揭示DEHP睾丸损伤机制。

结果:GSEA分析结果显示(图5),DEHP处理后HALLMARK基因集、凋亡相关基因集、P53信号通路显著富集。本文最终揭示了P53信号通路通过促进细胞凋亡和抑制Leydig细胞的增殖而参与DEHP诱导的青春期前的睾丸损伤。

图5 文章中的GSEA分析结果

案例二:转录组分析与本地鸡饲料效率相关的关键基因和通路[2]


目的:饲料效率的提高是家禽业的重要育种目标之一。本研究的目的是利用转录组分析因饲料效率而异的鸡胸肌相关的关键基因和通路。选择了5个效率最高(LRFI)和5个效率最低(HRFI)鸡胸肌进行转录组分析。

结果:LRFI鸟类中有24和325个已知基因显著上调和下调,富集分析表明,HRFI鸡炎症反应和免疫反应相关的基因和通路表达上调。此外,GSEA结果表明,LRFI鸡线粒体功能相关基因表达增加(图6)。蛋白质网络相互作用和功能分析揭示了ND2, ND4、CYTB、RAC2、VCAM1、CTSS和TLR4是影响饲料效率的关键基因。而吞噬体、细胞粘附分子(CAMs)、柠檬酸循环(TCA循环)和氧化磷酸化是造成饲料效率差异的关键途径。综上所述,通过生物信息学分析确定了一系列关键基因和通路。这些关键基因可能通过深度参与ROS的产生和炎症反应来影响饲料效率。

图6 文章中的GSEA分析结果

GSEA富集分析结果总图

GSEA分析的标准图形也有一些不足,它不能同时展示多个基因集,不能进行相互比较。因此由基迪奥开发的GSEA富集分析结果总图,它可以将显著富集通路或您关心的重点通路的富集结果展示在一张图形中,方便比较多个基因集。如图7所示,该图形分为3部分,左上部分展示预定义基因集在不同功能单位中(Pathway,GO Term或其他基因集)ES值累加过程中的增减变化曲线,不同功能单位中用颜色区分,可同时对比多条通路的ES值,帮助您快速锁定目标通路;右上部分表示各个功能单位(通路,GO Term或其他)全称;左下部分表示预定义基因集成员在功能单位中的位置,图形下方展示实验组与对照组的分布方向。

如需绘制该图可以使用OmicShare tools 动态GSEA工具:
https://www.omicshare.com/tools/home/report/report_gsea.html

图7 对GESA分析结果整合的总结果图形(KEGG分析结果)

目前该图形开发不久,在文章中还没有得到实际应用。我们来看下面的类似例子:转录组分析揭示了TGF-β在塑造组织常驻记忆CD8﹢T细胞与驻留有关的转录标记中的作用[3]


目的:组织常驻记忆CD8﹢T细胞(Tissue-resident CD8﹢ memory T , TRM)是永久存在于组织部位的免疫细胞,它们在提供快速保护以防止再次感染方面发挥重要作用,它们不仅在表型和功能上与其循环记忆对应物不同,而且表现出独特的转录特征。目前还不完全了解其发育和常驻所需的局部组织信号,但已证明可促进组织内TRM细胞的发育来源信号是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。因此,该文的研究目的是旨在确定来自多个组织的TRM细胞的转录特征在多大程度上反映了TGF-β的印记。

结果:对TGF-β处理组中上调和下调基因在上皮组织(皮肤,肠和肺)和非上皮组织(脑和肝脏)的组织特异性TRM相关基因集进行GSEA富集分析,TRM细胞中上调的基因在TGF-β处理组中具有较高的表达(图8A),而在TGF-β未处理组中表达下调的基因具有较高的表达(图8B)。

综上,这些结果支持了TGF-β信号传导在跨多个不同组织的TRM细胞中塑造转录特征的作用,也进一步说明TGF-β对不同TRM细胞群体中组织驻留的转录机制具有广泛的影响。

图7与图8的相同点是都将GSEA富集分析曲线整合在一张图中,不同点是图7展示的是两个比较组中不同基因集(如:Pathway,GO Terms)的GSEA富集结果,而图8展示的是TRM相关基因集在不同组织中的GSEA富集结果。总之,该图主要展示GSEA富集分析的全部显著基因集。

图8 TGF-β处理组中组织特异性TRM相关基因集的GSEA富集分析图

GSEA富集分析结果点阵图

同样地,标准GSEA分析图形不能展示一些关键基因,而GSEA富集分析结果点阵图可以展示某一个基因集的GSEA富集结果,并且展示关键基因名称。如图9所示,图形标题有2行,第一行为数据集的名称,蛋白酶体(ko03050:proteasome);第二行为富集分数ES的信息,FDR < 0.05,所以该基因集显著富集。图中的peak(红色竖线)将曲线分成了两面,第一面叫做leading edge,该面上的基因叫做leading targets,这些基因也是值得探索的基因(候选基因),说明有16个候选基因显著富集在蛋白酶体(ko03050)中。横坐标为Target ranks,表示Targets的排名;纵坐标为富集得分。

该图形可以使用R包Pi中的xGSEAdotplot函数绘制,绘制过程复杂难懂,因此我们正在开发绘制该图形的网页版工具(简单方便),敬请期待。

图9 GSEA富集分析结果点阵图

下面我们来看一下该图形的应用案例:转移性黑色素瘤患者外周CD8﹢T细胞特征与对免疫检查点阻断的持久反应相关[4]


目的:PD-1和CTLA-4的免疫检查点阻断(ICB)治疗转移性黑色素瘤(MM)具有不同的治疗效果。为了在外周样本中探索这一点,研究人员表征了一组单独接受抗PD-1(sICB)或与抗CTLA-4(cICB)结合使用的MM患者的CD8﹢T细胞基因表达。尽管对sICB和cICB的CD8﹢转录反应涉及一个共同的基因集,但cICB反应的强度却高四倍以上,并优先诱导有丝分裂和干扰素相关基因。

结果:具有持久临床益处的患者早期样本证明了T细胞受体编码基因的过表达。通过绘制T细胞受体克隆图谱,研究人员发现相应的患者与非相应的患者,治疗后的克隆数量更多(占全部的0.5%以上),这与效应记忆T细胞的百分比有关。8个治疗后样品的单细胞转录组测序表明,大量克隆过表达涉及细胞毒性和效应记忆T细胞特征的基因,包括CCL4、GNLY和NKG7。MM患者对ICB的6个月临床反应与治疗后21天的CD8﹢T细胞克隆计数有关,并且与克隆特异性无关,这表明ICB后外周CD8﹢克隆性可以提供有关长期治疗反应,并且可能促进治疗分层。

当然本文还讲到如图10所示的GSEA富集分析确定了25个通路(FDR <0.01),这些通路要么被cICB优先上调(例如参与有丝分裂纺锤体形成和G2M检查点的基因),要么被下调(包括通过NFκB传递的肿瘤坏死因子信号转导),反映了相对增强的细胞增殖和抑制的炎症,确定了联合治疗优先诱导或抑制的途径。

图10 对基于cICB显著调控的基因进行GSEA富集分析(文章中的部分图形)

总结

以上就是关于GSEA富集分析图形的详解,那具体怎样挑选重要通路呢?还是要根据自己的研究项目去挑选相关的通路以及重要基因。三种类型的图形可以挑选比较新颖的图形发表文章可能更受期刊编辑的喜爱,希望快要发文章的您尝试使用。

Tips:如果您觉得上面分享还不够用,那您可以在Omicsmart下单,享受全套的转录组或微生物组的个性分析,助力您在科研道路上越走越顺利。

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参考文献:
[1] Junke Wang, Tianxin Zhao, Jiadong Chen, Lian Kang, Yuexin Wei, Yuhao Wu, Lindong Han, Lianju Shen, Chunlan Long, Shengde Wu and Guanghui Wei, Multiple transcriptomic profiling: p53 signaling pathway is involved in DEHP-induced prepubertal testicular injury via promoting cell apoptosis and inhibiting cell proliferation of Leydig cells, Journal of Hazardous Materials, (2020).
[2] Yang, L., He, T., Xiong, F. et al. Identification of key genes and pathways associated with feed efficiency of native chickens based on transcriptome data via bioinformatics analysis. BMC Genomics 21, 292 (2020).
[3] Nath AP, Braun A, Ritchie SC, Carbone FR, Mackay LK, Gebhardt T, et al. (2019) Comparative analysis reveals a role for TGF-β in shaping the residency-related transcriptional signature in tissue-resident memory CD8+ T cells. PLoS ONE 14(2): e0210495.
[4] Fairfax, B.P., Taylor, C.A., Watson, R.A. et al. Peripheral CD8+ T cell characteristics associated with durable responses to immune checkpoint blockade in patients with metastatic melanoma. Nat Med 26, 193–199 (2020).

本文作者:基迪奥-Jusser              


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