查看: 2347|回复: 10

蛋白质谱定量技术又成长了——TMT pro

[复制链接]

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
236
注册时间
2020.6.16
在线时间
145 小时

发表于 2020.12.8 09:54:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2020.12.8 09:53 编辑

质谱在普通的蛋白定量和蛋白质翻译后修饰研究中都已有广泛应用,已成为蛋白质组定量最主要的分析技术之一。根据是否对目标蛋白进行定量可分为非靶定量和靶向定量。非靶定量根据是否进行标记,又能分为非标记定量和标记定量

一些根据科研临床需要保留下来的稳定又实用的蛋白定量质谱技术,仍然在不断完善和发展当中。曾经宣传更广的能标记到8个样本的iTRAQ,目前已逐渐被能标记到16标的TMT超越。而因为还要预先建库受到限制的DIA,技术已经成熟到能够放飞自我,不用预先DDA建库就可以进行鉴定,也已经能应用到磷酸化等修饰组学的分析当中。下面就来汇总介绍一下当下蛋白非靶向定量主流技术的进展和应用。

非靶向定量

非靶向定量蛋白质组学(Untargeted quantitative proteomics)技术是对样品中所有蛋白进行无差别的定量,方法有两类,标记和不用标记的定量。

标记定量

在不同蛋白质样品中添加同位素标记,称为标记定量技术。目前具有代表性的为体外化学标记的TMT(Tandem Mass Tag)技术。

①TMT原理

标记定量的关键在标记试剂,用的是同位素的原理,通过将不同的同位素标签与肽段特异氨基酸位点相连实现不同来源的肽段标记。TMT现在有6plex、10plex、11plex和16plex同位素标签,每种都有一个试剂盒,比如10plex就是包含了10种质量和化学结构相同、元素种类不同的同位素化合物(即同量异位素化合物)的标记,每个标记都由Amine Reactive group、Mass Normalizer和Mass Reporter组成

Mass reporter用不同类型同位素形成几种分子量,Mass Normalizer进行分子量消减,保证每个标记Mass reporter相对分子质量和Mass Normalizer相对分子质量加起来是相等的。比如3个质量报告基团相对分子质量分别是126、127、128,那质量调整区相对分子质量就是103、102、101,加起来都是229。质谱是依据质荷比进行检测的,所以要保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比。

对不同的蛋白样本进行酶解消化成多肽,使用不同的标记试剂对不用的样本进行标记,不同肽段带上了不同的标签。Amine Reactive group与氨基酸N端或赖氨酸发生反应,在一级质谱中,不同来源的相同肽段被标记后出现相同的质荷比,在同一个保留时间流出。在二级质谱中,Mass Normalizer断离,被不同标签标记的相同肽段出现不同的Mass Reporter,不同Mass Reporter的峰面积能反映出某肽段在当前样本的含量,通过比较不同Mass Reporter的峰面积就能找到某个肽段在不同样本中的表达差异。肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息,这些质谱原始数据经过数据库检索,就能确定蛋白质的定量信息了。

图1 TMT定量流程图

②TMT与TMTpro

TMT目前分为两套试剂方案TMT和TMT“加长版”:TMTpro。TMT方案,即传统意义上的TMT标记方案,早期最多进行6plex定量,后期增加同位素组合到最多11plex,但标记分子结构是一样的。TMTpro是最新方案,扩大了Reporter和Normalizer部分,用以容纳更多的同位素组合,目前最多进行16plex定量,定量原理和TMT一样。TMTpro由126-134Da左右报告基团给出定量信息,其中126,134为单峰,其余为N14,C14两种同位素谱峰,共16种。

图2 TMT(左)与TMTpro(右)标签化学结构功能区域示意图

③TMT特点与应用

TMT和非标记定量相比:

通过对样本添加不同的标记以区分样本对蛋白定量,TMT可以混样一次上机多个样本进行分析比较。TMT的数据采集模式为单次上机,最多同时定量16个样品,相比于利用unique肽段常规非标定量DDA模式,有更少的缺失值,数据记录更为完整。非标记定量多批次样品分级上机检测重复性不佳,而TMT可以通过分级比非标技术鉴定到更多的蛋白,但受限于DDA的扫描模式,低丰度蛋白偏少。并且存在的动态压缩效应导致定量值比实际值偏低,无法定量有无差异的蛋白。

所以,标记定量更适合于样本背景更为相似的(相同物种和相同样本类型),采用多种处理方式或多个处理时间的小样本(最多16个)的共有蛋白的比较,不适合样本中“有无蛋白”鉴定

TMT和iTRAQ相比:

你可能在很多地方听到的标记定量叫iTRAQ,或者TMT像个附加选择,那是因为两种技术原理相似,由Thermo Scientific公司研发TMT多肽体外标记技术,比AB Sciex研发的iTRAQ上市更晚,市场知名度低一些,而且早期TMT能标记的样本数量也少,但现在该技术现在已达到能用16种同位素标记多肽的氨基基团,已超越了iTRAQ标记8个样本的限制,也具备了iTRAQ暂时未超越的优势。

iTRAQ标记的分子量大于TMT,标记分子量越大肽段疏水性越强,定性数量会越少。另外,iTRAQ标记最后一步试剂为异丙醇,TMT为乙腈,而质谱流动相为乙腈/水,所以TMT兼容性好于ITRAQ。同等MS分辨率,对6个样本进行定量,TMT定量数会更多。

之后市场竞争的结果如何,我们不得而知,但目前来看,TMT性能是更好的。

TMT和TMTpro应用相比:

TMTpro标记样本数多意味着标记批次减少,避免之前内标搭桥等方式,能够进一步减少定量数据丢失。其中在TMT标记中,127N和127C有约0.006Da的分子量差异,为了能够准确区分该差异并定量,质谱仪的MS/MS分辨率最好大于45000。但MS2分辨率要求越高,定性数量也会随之降低。由于新结构更加庞大,疏水性增加,会略影响定性数量,因此定量<12个样品的时候依然建议采用TMT方案

TMT瓶颈与突破:

标记定量蛋白质组技术,其优势在于将所需比较的样品标记后混在一起无偏好地同时进行后续实验和质谱检测,消除了系统实验误差,使得定量可比性更直接。但多种肽段共流出造成干扰,产生动态压缩效应也一直是标记定量技术的瓶颈。

蛋白质组学样本非常复杂,在色谱分离中会存在肽段没有区分开共洗脱的现象。而质谱在选择母离子进行二级分析时,分子量接近的共洗脱肽段被同时选择,碎裂出的报告离子与目标肽段报告离子叠加,干扰了报告离子的强度,造成肽段和蛋白的定量比例低于真实比例。也就是说,实际定量检测到的差异倍数会比真实差异倍数小。

目前,可以通过分级以及质谱仪的TMT SPS MS3定量方式或TurboTMT提高定量准确性。分级可以提高TMT的鉴定、定量数量,减少谱图高度拥挤,母离子共流出比例,但分级方法不适用于非标记定量,由于多批次样品分级重复性不佳,仅用于定性建库。

图3 分级后明显提升了定量数量

TMT SPS MS3采用MS/MS谱图定性,同时自动选择的确归属于该母离子的肽段碎片离子进行MS3碎裂,识别其中正确归属于该肽段的报告离子进行定量,充分消除共流出效应。MS2定量方法比SPS MS3定量方法可以鉴定并定量到更多的蛋白质,而SPSMS3能鉴定并定量到更多低丰度的蛋白,定量结果也更加准确。

图4 MS3鉴定流程

QE系列质谱无法采集MS3谱图,故不适用SPS技术,新推出的Exploris 480内嵌的TurboTMT方法,采用Precursor FIT算法,自动计算母离子隔离窗口(即进行MS/MS扫描的母离子质量范围)内目标母离子的丰度>75%才进行MS/MS碎裂和定量,通过该方法来大幅降低共流出效应。TMTpro及TMT7标以上实验均需要分辨率45000以上的MS/MS扫描完成,越高的MS/MS分辨率会降低单位时间的多肽检测数量。TurboTMT的Φ-SDM算法可以在15000分辨率的条件下实现等同于45000分辨率的谱峰区分度,从而避免了7标以上TMT必须降低扫描速度,牺牲鉴定量来提高定量准确性的问题。

图5 Turbo TMT新算法降低共流出效应

TMTpro最多定量16个样品,定量更多样品则必须采用混标多批次检测方式,即将某一通道标记所有分组样品的混合作为矫正通道,对多批次定量结果进行批次矫正。但是标记操作无法做到完全重复,分级也不可能完全一致。该方法在组间差异较小时可以矫正部分批次效应,但在大规模样品定量时依然无能为力,DIA定量则可以避免该问题。下一篇我们将给大家详细解析DIA的原理和应用。

基迪奥蛋白项目的文章在各领域一直在不断产出,比如用蛋白标记定量探究基因HtrA2在结肠炎病程中的分子机制(Cell Death & Disease,IF=5.959)[1],用DIA结合代谢组研究乌龙茶制作过程中非挥发性化学物质形成机制(Food Chemistry,IF=5.399)[2],蛋白和转录组分析海水酸化增加海带碘积累的机制(Global change biology,IF=8.997)[3]等等,如果你刚好也需要基迪奥帮你完成蛋白定性定量分析,可以在评论区留言,或者直接联系当地销售进行咨询。

图6 基迪奥TMT蛋白定量分析流程图

参考文献:
[1]        Zhang C, He A, Liu S, et al. Inhibition of HtrA2 alleviated dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis by preventing necroptosis of intestinal epithelial cells[J]. Cell death & disease, 2019, 10(5): 1-14.
[2]        Wu L, Huang X, Liu S, et al. Understanding the formation mechanism of oolong tea characteristic non-volatile chemical constitutes during manufacturing processes by using integrated widely-targeted metabolome and DIA proteome analysis[J]. Food Chemistry, 2020, 310: 125941.
[3]        Xu D, Brennan G, Xu L, et al. Ocean acidification increases iodine accumulation in kelp‐based coastal food webs[J]. Global change biology, 2019, 25(2): 629-639.

本文作者:基迪奥-萌神
               

本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
1
注册时间
2020.11.10
在线时间
12 小时

发表于 2020.12.8 11:45:41 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.12.22
在线时间
80 小时

发表于 2020.12.9 08:12:34 | 显示全部楼层
学习
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.12.22
在线时间
80 小时

发表于 2020.12.9 08:13:08 | 显示全部楼层
学习
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.12.22
在线时间
80 小时

发表于 2020.12.9 08:13:39 | 显示全部楼层
学习
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.12.22
在线时间
80 小时

发表于 2020.12.9 08:14:22 | 显示全部楼层
学习
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2018.12.22
在线时间
80 小时

发表于 2020.12.9 08:14:53 | 显示全部楼层
学习
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
37 小时

发表于 2020.12.9 09:15:21 | 显示全部楼层
学习
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
1
注册时间
2020.11.10
在线时间
12 小时

发表于 2020.12.9 21:14:08 | 显示全部楼层
学习学习
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2020.2.12
在线时间
46 小时

发表于 2020.12.10 09:02:44 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2020.10.8
在线时间
2 小时

发表于 2021.4.22 15:21:06 | 显示全部楼层
好!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表