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[转录组] 转录组助力文昌鱼再生机制研究 发文IF5.4

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    发表于 2019.8.15 09:30:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
    今天给大家分享一篇基迪奥客户合作文章,利用转录组分析文昌鱼鱼尾再生的分子机制的客户文章,发表在期刊Development(IF=5.41)上。文章的思路清晰明了,非常值得借鉴。


    合作单位:中国海洋大学

    发表期刊:Development(IF=5.41)


    再生是再生身体缺失部分的能力,这在后生动物中广泛存在。文昌鱼是一种头索动物,与脊椎动物有许多解剖学、发育和基因组上的相似之处,但更为简单。因此,它是研究从无脊椎动物转变到脊椎动物再生能力和机制的理想动物。然而,文昌鱼尾巴再生的细胞和分子基础在很大程度上仍不清楚。

    实验取材

    挑选完整尾部、尾部截肢后14h、5d、15d、25d的文昌鱼进行测序,每组两个生物学重复。

    研究思路


    图1.研究思路



    结果解读

    1.文昌鱼尾部细胞的再生过程
    文昌鱼尾部细胞的再生过程分为创面愈合期和囊胚期,为了检测这两个时期的尾部细胞的凋亡和增殖情况,作者采用TUNEL法检测细胞凋亡,并采用BrdU标记法检测细胞增殖。
    实验表明,在创面愈合阶段,细胞凋亡主要发生在创面附近和上皮细胞内(图2A,B)。相反,在囊胚期,细胞死亡较少(图2C,D),表明细胞凋亡主要发生在创面愈合阶段。而囊胚内的细胞处于活跃的分裂状态(图2E,F)。这个再生的过程与脊椎动物的外胚形成再生过程相似。


    图2. 文昌鱼尾巴再生过程中的细胞凋亡和增殖


    2.文昌鱼的转录组分析

    为了系统探索文昌鱼再生过程的分子机制,作者对不同阶段的尾巴再生进行了转录组分析(完整尾部、尾部截肢后14h、5d、15d、25d)。对不同组进行差异分析和富集分析,GO富集分析显示差异基因主要富集在与伤口愈合和防御反应相关的term。
    这些term中大多数基因在完整的鱼尾中表达水平最低,但在尾巴再生的14h(早期伤口愈合阶段)表达水平最高,在尾再生5d(伤口愈合后期阶段)表达水平居中。这一趋势表明,这些基因在创伤愈合过程中起着重要作用。
    此外,大多数与细胞周期相关基因在鱼尾再生囊胚期(15d和25d) 上调,其中15d的表达水平最高(图3)。这表明细胞增殖在囊胚期是活跃的,与之前在尾巴再生过程中BrdU标记法检测细胞增殖的结果一致(图2E,F)。


    图3.差异基因在不同再生阶段的表达情况


    3.bmp2/4由创面诱导表达于创面愈合期创面部位

    BMP信号通路是参与发育和再生过程的重要信号通路之一,因此作者重点研究BMP信号在文昌鱼再生过程中的作用。从转录组结果中发现了BMP信号通路的bmp2/4和其他关键基因参与了文昌鱼尾巴的再生过程。
    bmp2/4在创面愈合阶段表达量较高(图4A,B,E),但在再生进入囊胚阶段后表达量急剧下降(图4C,F)。同时,作者还通过BMP2/4的qPCR实验和免疫组化染色,发现BMP2/4主要分布于创面愈合阶段创面区域 (图4G,H),进一步支持了BMP2/4在创面愈合阶段创面部位特异性表达的发现。
    此外,作者还测试BMP2/4是否会被其他类型的普通伤口诱导,如穿洞、划伤等,并在损伤后不同时间点(0-8 h)用原位杂交检测bmp2/4的表达。结果发现,所有的创面部位及创面附近区域均有BMP2/4表达(图4I -P),说明bmp2/4表达可能受创面诱导。


    图4. bmp2/4在文昌鱼尾巴的再生过程的表达量变化


    4.BMP2/4基因敲除抑制了尾巴的再生,增加了细胞的凋亡

    为了了解BMP2/4是否会对尾巴再生起作用,作者对刚被截肢的伤口区域敲除BMP2/4抑制其表达。抑制BMP2/4后,伤口无法愈合,最终腐烂,而对照组通过了伤口愈合阶段,并成功地产生了囊胚。表明敲除BMP2/4会损伤尾部再生。
    为了进一步BMP2/4在再生过程中的作用机制,作者先比较基因敲除组与对照组细胞创面愈合期的凋亡情况。结果显示BMP2/4敲低导致肌肉和脊索细胞凋亡增加(图6I,J),表明可能是由于敲除BMP2/4基因后导致细胞凋亡,从而使尾巴再生失败。
    随后,作者研究BMP2/4在伤口愈合后的尾巴再生过程中的作用,对切除文昌鱼尾部的13d早期囊胚期抑制BMP2/4的表达,结果显示胚基都向腹侧生长,而随后一定程度恢复正常,表明抑制BMP2/4的表达会影响胚基的生长,但在再生过程中具有较强的自我调节能力。


    图5. BMP2/4基因敲除对文昌鱼尾部再生的影响


    6.BMP信号参与尾巴再生

    为了进一步验证BMP信号通路参与了尾巴的再生过程,作者对该通路的如smad1和smad4等相关基因进行验证。原位杂交实验表明,在创面愈合阶段,所有检测到的基因均表现出与bmp2/4相似的表达模式。

    为了进一步阐明BMP信号的作用,在截尾后立即用BMP信号的天然抑制剂阻断BMP信号。当BMP信号被阻断时,动物无法通过创面愈合阶段,不能形成芽基(图6 D-F),而对照组则能形成正常的胚泡(图6A-C)。这些结果表明,BMP信号是尾巴再生所必需的信号通路。


    图6.在尾巴再生过程中抑制BMP信号通路

    文章小结

    作者通过对文昌鱼转录组的分析,初步找到了与细胞增殖相关的基因,再从明星通路入手,找到了鱼尾再生过程中关键的BMP基因和BMP通路,并使用多种实验方法进行了验证,阐明了在文昌鱼尾巴再生过程中的BMP的重要作用。文章的思路清晰明了,通过寻找明星通路的方法从众多的结果中快速定位了关键基因和通路,是个非常值得借鉴的方法。


    本文作者:基迪奥半夏

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