【50奥币已发放】宏基因测序后怎么验证？除了qPCR还能做...

WatsonWoo

鉴于现在只做测序难发文章，请教16s及宏基因组测序做完后，验证方法。
是挑几个做qPCR么？或者有什么其他验证方法？


个人感觉8楼和9楼朋友说的很有道理。

9楼是说总思路，8楼是流程。

另外，5楼的给出了一个现阶段流行的一种套路。

本人参考了各位建议，想了很多，现在就个人思路总结下：
微生物研究难点：难人工分离培养~！  所以现在有了宏基因组。

也是楼下朋友说的，宏基因组等只是预测。我个人结合朋友们的回家总结了这些后续研究思路；
a、分类学研究，即预测后的人工分离培养。用于确定环境微生物的确切信息。尽量多的培养提取微生物，从而验证环境微生物预测，完成试验猜想。具体培养方法就如同楼下朋友所说，用不同优势培养基培养、扩繁、提取、测序。

b，多组学验证预测。就是从不同层面的再次预测。方法就选用二代、三代测序，从蛋白、甲基化（只是举个栗子，不一定就真的就是这。形态学、代谢组、转录组等不同层面。）。。。。等等再次预测，以达到相互印证。

c、基于方法a的后续进行形态学、代谢组学等研究。不测序，直接在培养扩繁过程中研究形态学、代谢等。。。

d、meta分析。个人想到的一个方法。这个meta分析是需要结合研究课题的目的，从试验问题出发，通过已有的大量测序数据（同行或类似结果），从统计学角度对自己试验结果可靠性的一个评估。从而再回归到本研究目的，一定程度上解决自己的试验问题。meta分析需依据相似环境的结果，这个我只是个想法，可能不太成熟，希望各位补充

期待大神的出现，欢迎各位继续批评指正。

小圆

很好的问题，谁能解答一下，小圆给送50奥币

martin1207

跟顶，我只会看

kexylh

我想是不是可以做一下分离培养啊，看看分离比例，跟测序结果趋势是否一致。剩下的是不是就要跟试验目的挂钩，看看怎么设计实验啊。

iMicrobe

个人建议， 主要不同技术和方法的交叉验证， 验证方法主要取决于课题的研究目的

可补充的技术手段
1. 单细胞测序
2. qPCR
3. FISH，SEM， TEM， 或者其它的显微镜手段
4. 如果验证代谢情况的话，测代谢组用UPLC-MS
5. 做RNA方面的证据， Metatranscriptomics
6. 运行实验验证功能(用高大上的CRISPR技术操纵Meta---国际前沿)
7. 最牛逼最踏实的方法  culture，拿到纯菌， 你可以玩更多
。。。。。。。。。。。

yulin

学渣默默围观，学习学习，没准以后大神们的讲解让我茅塞顿开

开挂

iMicrobe 发表于 2016.4.12 08:28
个人建议， 主要不同技术和方法的交叉验证， 验证方法主要取决于课题的研究目的

可补充的技术手段

围观学习

山大辰星

本实验室做法：取到样品后，一部分送去测宏基因组，一部分用于涂布计数筛选，还有一部分用于富集培养。
在涂布计数方面，选用不同的培养基（普通细菌专用，放线菌专用，弧菌专用。。。。），不同的培养条件，尽可能统计出所有的细菌数目。然后进行挑选，只要是外表不一样的都挑出来进行纯化测序，确定其分类地位。富集培养部分，由于富集培养会大大降低原有优势菌群的数量，使一些细菌群落中的劣势菌株得以生长，然后再把富集培养后的成分在不同的时间点测宏基因组，涂布计数，再重复初步分离的工作。最后将宏基因组数据和鉴定的可培养细菌的数目进行比对分析。

fengqiu

个人觉得，这个问题不能一概而论，要和具体的实验目的结合起来综合分析。一般而言，宏基因组测序是一种技术手段，楼主应该是想和生物学功能进行结合，回归和解决生物学问题。
采用宏基因组学的方法可以揭示微生物群落的组成、结构、群落功能等， 这些结果可以说是对整个“微生物库”的反映，但并没有直接揭示这些微生物在环境中具体发挥了哪些生态学或生物学功能。要客观全面地解决这一问题，还需要结合微生物类群数量、qPCR/dPCR 基因定量、宏转录组学、 宏蛋白组学、纯培养验证等手段综合研究并加以分析。此外，除了分子手段，还可以从生理生化水平进行分析，可以检测微生物的酶活，可以对特定类群的微生物的功能进行分析，也可以检测元素的含量变化，比如做碳氮循环研究，可以采用同位素示踪方法进行深入分析。
总之，目前的技术手段很丰富，需要结合具体的实验目的，找到相应的技术方法，最终解决生物学问题。

iMicrobe

iMicrobe 发表于 2016.4.12 08:28
个人建议， 主要不同技术和方法的交叉验证， 验证方法主要取决于课题的研究目的

可补充的技术手段

尽量补充一下：
1. 单细胞测序可以拿到单个细胞的基因组序列，对于组装不上的那些基因组是很好的参考
2. qPCR 能够方便的定量你想要研究的marker gene
3. FISH， 图片显示你所关心的微生物在样品中的存在
4. 如果体系够简单，代谢组可以研究微生物之间的相互作用
5. Meta转录组看代谢， 开始设计就要考虑
6. CRISPR 自行参考文献
7. 这个你们比我会玩
8. isotope看元素
。。。。。。。

很多都只是了解，并没有所有都做过项目

WatsonWoo

还有，我自己再补充一点，原本想着宏转录组结合上也许会更好一点，但据说，宏转录组假阳性非常高。

这点是我道听途说的。仅供参考。

Isoforms

测了宏基因组以后可以挖掘的信息肯定很多，往多样性和进化方面靠，再测点转录组，蛋白组，应该可以找到很多可以讲的故事，不过大故事还得做实验验证。微生物上面甲基化做的多吗

audi1989

学渣来学习了！

weiweiperson@16

山大辰星 发表于 2016.4.12 16:29
本实验室做法：取到样品后，一部分送去测宏基因组，一部分用于涂布计数筛选，还有一部分用于富集培养。
在 ...

有没有按这个思路做出来的文章啊，求发来学习一下啊

山大辰星

weiweiperson@16 发表于 2017.1.18 12:26
有没有按这个思路做出来的文章啊，求发来学习一下啊

我们实验室的这篇文章刚投出去，还没接受，出来了再上传。

南岸微风

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