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[转录组] 基迪奥合作客户文章:转录组+靶向代谢组文章发表

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    发表于 2017.8.24 11:07:55 | 显示全部楼层 |阅读模式

    推荐一篇小师妹的微文,全文如下:


    做完RNA-seq,除了可以用qPCR(荧光定量PCR)进行验证,还可以用什么方法进行验证?

    今天就给大家解读一篇发表自青岛生物能源与过程研究所的基迪奥客户文章,文章采用了“转录组结合靶向代谢组”的方法,研究浮萍在缺氮环境下淀粉积累的分子机制。





    发表杂志:《Biotechnology for Biofuels》


    影响因子:5.203


    文章题目:联合转录组与靶向代谢组研究浮萍缺氮下的淀粉积累分子机制

    研究背景与目的

    浮萍是一种分布广泛的水生植物,常用于水体污染(如营养水体、重金属污染等)的生物修复。由于其繁殖快、在特殊环境下能快速积累淀粉的特性,因此也是很有潜力的生物能源。但是,各种环境因素(如缺氮、极端温度、盐渍等)对浮萍淀粉积累影响的分子机制目前还研究得较少。因此,本文通过转录组来研究浮萍在缺氮环境下淀粉积累的分子机制。

    实验设计

    在含有10g/L蔗糖的去氮培养基中培养0,3,7天的浮萍,进行RNA-seq。两个重复。

    研究结果
    1.缺氮培养下可引起浮萍淀粉积累

    利用Megazyme total starch assay kit和periodic acid–Schif (PAS) staining方法研究缺氮对浮萍淀粉积累的影响。结果显示浮萍在缺氮环境下可以显著积累淀粉(图1)。




    图1缺氮培养下可引起浮萍淀粉积累

    2.转录组分析

    对在含有10g/L蔗糖的去氮培养基中培养0,3,7天的浮萍进行RNA-seq测序与分析。与0d组相比,3d组鉴定出2522个差异基因,7d组鉴定出628个差异基因。

    对差异基因进行趋势分析,其中cluster2和cluster5是两个显著趋势。Cluster2趋势中的基因在3d时表达量显著下调,功能富集分析显示这些基因与氮代谢、光合作用、类胡萝卜素合成、氨基酸合成、不饱和脂肪酸合成等代谢通路相关;Cluster5趋势中的基因在3d时表达量显著上调,功能富集分析显示这些基因与淀粉和糖代谢、糖原降解、乙醛酸代谢等代谢通路相关(图2)。





    图2 差异基因趋势分析结果


    3. 缺氮引起的代谢通路变化

    1)淀粉合成通路

    淀粉合成涉及到一系列的关键酶,包括可溶性淀粉合成酶(SS)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)、颗粒性淀粉合成酶(GBSS)、淀粉支链酶(SBE);而淀粉降解是由α淀粉酶和β淀粉酶催化的。差异表达分析结果显示在缺氮培养下与淀粉合成相关的100多个基因差异表达。

    RNA-seq结果和qPCR验证结果显示,编码AGP和SS的转录本在缺氮条件下表达量显著上升,而编码GBSS和SEB的转录本表达量没有显著变化(图3,4)。另外,与糖异生相关的酶基因的表达量显著上升,而与糖酵解相关的酶基因的表达量则显著下降。这些结果说明浮萍在缺氮环境下,更多的葡萄糖1-磷酸会进入到淀粉与蔗糖合成途径中。

    腺苷二磷酸葡萄糖(ADP-glucose)是淀粉合成的供体,是通过葡萄糖1-磷酸+ATP酶促反应形成的。而葡萄糖1-磷酸可以被UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转移酶和UDP-葡萄糖-6-脱氢酶催化成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP- glucose),从而与淀粉合成竞争底物。RNA-seq结果中,编码UDP-葡萄糖-6-脱氢酶的转录本表达量在缺氮环境下显著下降,从而促进了淀粉的积累。

    2)氮代谢通路

    共有30个与氮代谢相关的基因差异表达,这些基因在缺氮环境下表达量下降,包括硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶,表明了浮萍在缺氮环境下亚硝酸盐和NH3的含量减少。

    3)光合作用

    与光合作用相关的基因在缺氮环境下表达量显著下降,包括参与光合作用系统二和电子传递链的基因。另外,对叶绿素a和叶绿素b的含量进行测定,也发现两者的含量随着缺氮时间的延长而逐渐降低。这些结果表明浮萍在缺氮环境下,光合作用减缓、光合色素减少。

    4)氨基酸代谢通路

    在缺氮环境下,与氨基酸合成相关的基因表达量下降,蛋白质含量也下降,这有利于淀粉的积累。



    图3 qPCR验证结果



    图4 浮萍在缺氮环境下的代谢变化

    4. 代谢物含量变化分析

    为了验证RNA-seq的结果,利用LC-MS/MS对数个关键代谢物的含量进行靶向检测。结果显示,在缺氮培养3天和7天,腺苷二磷酸葡萄糖(ADP-glucose)的含量不断增加,与此相反的是,尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)的含量不断减少(图5)。对AGPase和UGPase的酶活实验结果显示,AGPase的酶活性显著增加,而UGPase的酶活性显著下降(图6),这些结果与转录组和代谢组的结果一致。

    对糖酵解和糖异生代谢通路中的代谢物进行检测,发现果糖1,6二磷酸和果糖6-磷酸的含量显著增加(图5),因此推断TCA循环的中间产物α酮戊二酸和草酰乙酸更有可能通过糖异生途径影响淀粉合成。

    另外,葡萄糖6-磷酸和葡萄糖1-磷酸的含量也在缺氮下显著增加,这些结果都与转录组结果一致(图5)。


    图5 代谢物变化热图



    图6 酶活实验

    结论

    本文通过对缺氮条件下的浮萍进行转录组测序和靶向代谢物检测,阐明了浮萍淀粉积累的分子机制:在缺氮环境下,细胞内代谢流发生改变,一方面减少代谢旁支氨基酸和细胞壁(果胶、脂质)的代谢流向,另一方面增强糖异生和TCA循环,ADP-glucose含量增加,从而淀粉得以积累(图7)。



    图7 浮萍缺氮环境下的碳水化合物代谢变化总体示意图

    本文采用靶向代谢组的方法,很好的验证了RNA-seq的结果。我们都知道,RNA-seq通常可以得到成百上千的差异基因,这些差异基因中很可能有很多都是假阳性的,或者是与研究目的不相干的。而代谢物是生命活动的最下游产物,反映的是机体受环境刺激影响的最终状态,因此结合代谢通路上代谢物的检测验证,可以更快速准确地筛选与验证RNA-seq的结果,使得结论更充分有力,发文章也就更高分啦!

    参考文献:
    Yu C, Zhao X, Qi G, et al. Integrated analysis of transcriptome and metabolites reveals an essential role of metabolic flux in starch accumulation under nitrogen starvation in duckweed[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1): 167.


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    我要看看,我到底有多么的喜欢你!
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    发表于 2017.8.28 09:15:26 | 显示全部楼层
    靶向代谢组提供了新的验证策略,不错不错
    我说今晚月光那么美,你说不是的
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    请教:对差异基因进行趋势分析,大神能详细讲一下吗?
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    发表于 2017.8.30 09:52:07 | 显示全部楼层
    两个重复也发了5分,可以啊
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    学习学习,最近也想整个代谢加转录的
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    很好的思路,值得借鉴
    战拖
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    发表于 2018.11.2 11:26:00 | 显示全部楼层
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  • TA的每日心情
    好棒
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    [LV.3]偶尔看看II

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