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[技术前沿] GUIDE-seq可准确检测CRISPR脱靶效应

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发表于 2017.7.14 10:01:09 | 显示全部楼层 |阅读模式
CRISPR可谓是近年来生物界的焦点,其针对复杂有机体基因组特定位点进行操作(突变、插入或缺失)的手段对生物学和医药学的发展至关重要。这项技术相对于ZFN、TALEN等基因打靶技术可以说是简便、经济得多,一般的实验室都可以构建自己的平台。CRISPR/Cas9基因组编辑目前正应用得如火如荼,但若要转化到临床应用,准确检测脱靶效应则是必不可少的。

CRISPR脱靶带来的烦恼
早在2013年,来自麻省总医院的研究人员发现使用CRISPR-Cas系统有一个重要局限:CRISPR-Cas会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。此后陆续有研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性,即该技术会发生非特异性切割,引起基因组非靶向位点的突变,这样会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加,这一问题也严重地限制了Cas9的应用。

在全基因组范围鉴定脱靶效应的方法时有报道,但这些方法有可能错过低频率的脱靶突变,而且高效转染的要求也限制了其应用。以往人们在检测CRISPR-Cas诱导的脱靶DNA断裂时,往往事先假定脱靶位点与靶位点相似。然而许多脱靶突变发生在与目标位点差异很大的地方,因此脱靶DNA断裂的数量和位置是很难预测的。GUIDE-seq是一种通过高通量实验手段在全基因组范围鉴定脱靶效应的方法,而且它相当灵敏。

评估脱靶效应的利器——GUIDE-seq

GUIDE-Seq高通量测序技术能够很好克服以上问题,它极大提升检测通量,节省实验时间,同时在低转染效率的情况下保持高灵敏度的低频突变检测效率,提高检测准确性。

其原理是,利用一种短双链寡核苷酸标签来标记CRISPR-Cas诱导的断裂(在靶和脱靶),然后对标签所在的基因区域进行高通量测序,最后利用生物信息学分析确定脱靶突变的位置以及突变频率。研究表明,就算某个脱靶突变的出现频率低至0.1%,通过GUIDE-seq也能够检测得到。


图1. GUIDE-seq分析原理


图2. GUIDE-seq分析流程

GUIDE-seq技术优势

现有脱靶评估工具主要是通过分析目标序列来完成,但研究显示,这些工具不但在预测脱靶位点检测率低,还存在假阳性率高等情况(错误检出实际不被酶切位点)。

相比之下,GUIDE-seq不需要高效转染,从而避免了对细胞适应性的影响。此外,活性核酸酶的浓度可以尽可能的高,从而将低频率突变一网打尽。同时,GUIDE-seq具有更高的信噪比,且需要的测序reads量少,在鉴定全基因组的脱靶位点时,它有望实现更高的灵敏度。这种特性都使得GUIDE-seq在鉴定全基因组的CRISPR/Cas9脱靶突变上,比现有的细胞或生化方法表现更佳。

实验结果

通过GUIDE-seq高通量测序技术,对HEK293细胞系的三个靶点位置进行筛选,最终筛选出sgRNA在靶效率更高的site 2位点,从而提升了CRISPR编辑的准确性[1]。


注:第一行为预期靶序列(在靶位点),与靶序列不一致的碱基则高亮显示;序列右侧为每个(在靶/脱靶)位点测序得到的reads数目;在靶序列用黑色实心方块标识。

如何设计实验?

想利用这么方便的技术检测自己的CRISPR在靶效应,却不知道如何操作?联系我们,就会有专业的技术人员为你设计特定的短双链寡核苷酸标签。如果遇到实验问题,我们还会派发相关实验资料并指导客户进行简单的实验操作。

以下为送样参考:
  • 样本类型:完成CRISPR-Cas基因操作并加入dsODN的细胞样本或DNA样本(基迪奥提供专门技术指导)
  • DNA样本量:总量3-5 μg,浓度30ng/μL,无明显降解
  • 细胞样本量:1×106 个细胞或10 cm2 培养面积


参考文献:
【1】Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187–97 (2015).


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。。。。。。
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中华鲟

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发表于 2017.8.6 16:56:30 | 显示全部楼层

最近在验证编辑后蛋白的表达,感觉可以和老板讨论讨论
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中华鲟

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发表于 2018.12.3 11:08:53 | 显示全部楼层
这个技术很早之前就有了吧
早上好
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迅猛龙

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迅猛龙

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迅猛龙

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迅猛龙

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