第14期“基因表达量计算与差异表达分析（下）”【视频】

小圆

第14期在线交流

RNA-seq中的基因表达量计算和差异表达分析（下）

交流时间：2016年3月16日下午4点-5点
交流QQ群：425346734
交流嘉宾：周老师

在上周交流中，我们主要讨论了RNA-seq表达量计算的方法，我们主要讨论了两点内容：

（1）表达量不同计算方法间的区别，也就是RPKM、FPKM、TPM的区别。
（2）表达量不同校正方法的区别，主要分享了Deseq软件校正策略背后的逻辑（中位数校正），以及遇到问题数据的时候该如何处理。

在下周（3月16日）的交流中，我们重点讨论后续的差异表达分析。

交流主要内容涉及以下问题：

（1）基础理论介绍
通俗解释表达差异分析背后的基本原理。
为什么在RNA-seq中没有生物学重复，也能实现差异分析的统计。

（2）不同差异分析方法的比较
有生物学重复和无生物学重复，背后的统计策略有何不同
Deseq、cuffdiff等软件差异分析的原理是什么？
为什么不同方法得到的P value值不同
差异分析为什么输入的数据是reads counts，而不是RPKM值

（3）不同方法的实际应用
如果差异分析，结果不显著该怎么办？
为什么方差分析不适合用于差异表达分析。

备注：本次培训的背景知识包括：
（1）序列比对——如何将read比对到参考基因组
（2）Read在基因的表达量分配——多重比对的reads在可变剪切和基因家族间如何分配


报名地址：http://ke.qq.com/course/120303#term_id=100132078




PPT下载（在16日培训完成后最新更新）：

小圆

交流视频来了！！  拿走不谢~~

http://www.omicshare.com/class/Home/Index/singlev?id=8

小圆

本次在线交流问答整理如下：

问1：在没有重复实验的情况下，用RPKM要怎么做检验呢？

答：如果要用泊松分布做差异分析模型的话，必须要用reads count的。只有RPKM值的话，可以用RPKM的公式反推reads count数，再做检验。

问2：Deseq是怎么控制reads多重比对的？

答：Deseq只是一个差异分析的软件，多重比对的分配是在Deseq之前的。Deseq是输入的数据是已经分配好的reads count，然后用于分析，但是如果reads 多重比对要怎么处理的，那么要使用reads分配分析软件，例如cufflinks或Rsem软件。所以Deseq是不能处理多重比对的，应该之前用软件进行预处理。一般来说多重比对有两种方案：

1）如果一个reads多重比对的话，可以把多重比对的reads删除掉，

2）使用cufflinks 和 Rsem分配比对结果bam文件；

如果不关心可变剪切的差异，策略1也是合理的。如果关心可变剪切，则建议策略2。

问3：Deseq、edgeR和cuffdiff在处理多重比对reads的时候差别是什么？

答：Deseq与edgeR只是一个差异分析的软件，就是类似于做方差分析的软件一样。但cufflinks是个软件包，从数据比对到reads count 到差异分析都全包了，所以如何处理多重比对的reads是与 Deseq或者edgeR是无关的。可以用cufflinks或者RSEM来做多重比对的处理，然后做差异分析，则可以继续选用 Cuffdiff 、Deseq或 edgeR。

问4：用TMM标准化之后再用基于泊松分布的差异分析算法，计算差异基因靠谱吗？

答：TMM标准化的确是独立的方法。既然有生物学重复就不建议用泊松分布模型。因为TMM是edgeR的归一化算法，建议后续的差异分析继续使用edgeR。泊松分布可以做差异分析，但是这个方法无法估算生物样本之间的个体差异。所以他最后是相当于低估了P值，统计结果是存在较大假阳性。

问5：如果想比较环境对基因表达的差异，分别从两个地区各取三株样品，比较组间差异可以吗？

答：可以。这个方法是可行的，但是有一点，目前我认为RNA-seq最大问题是如果只测三个生物学重复，对模式生物来说还是OK的，比如小鼠、拟南芥，他们个体差异很小。我们知道个体差异本来就是组内差异的一部分。所以对于模式生物来说一开始个体差异是非常小的。但是如果从两个区域取样的话，而且非模式生物学样本，例如林木、昆虫，可能个体差异会比较大，容易得到组间差异不显著的结论。所以想得到一些更稳定的指标的话，建议用混样作为生物学重复来做差异比较将会更加稳定。

用混样作为样本的逻辑是这样的，比如在某个区域取到30个样本，然后把每10个样本混成一个池，比如前十个，中间十个，后面十个，构成三个样本池，这个时候其实这三个样本池还是不一样的。生物学重复本身就是假设是抽样，从一个大样本中抽样，来计算抽样误差多大，如果将个体作为重复的话，这种个体差异比较大，这样就导致抽样误差比较大。但是如果以群体作为样本的话，因为群体的均值更加稳定，得到样本间差异将更小，所以我们才会建议所有样本混合成若干池，这样减少抽样误差。

查看完整问答整理戳这里下载：

朱强龙

期待

Arya

期待周老师的课~

jianjian1105

又能够充电了，呵呵

开心豆

platove

zhouyulu

期待视屏，需要反复理解学习，周老师的课

djping8199

很期待

alipe2015

期待中～

蓝海豚

我等的花儿都谢了
我等的海儿都枯了
你知道我会永远永远等你给我的回答

platove

epigenome

期待中。。。

flowering

解决了我一大难题啊

stoni

很棒的资料

yuzhe891

wangzhaoyi

感谢分享

caiyun

有录播 吗

wang

澳币有没有