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第14期“基因表达量计算与差异表达分析(下)”【视频】

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发表于 2016.3.9 14:39:16 | 显示全部楼层 |阅读模式
第14期在线交流

RNA-seq中的基因表达量计算和差异表达分析(下)


交流时间:2016年3月16日下午4点-5点
交流QQ群:425346734
交流嘉宾:周老师


在上周交流中,我们主要讨论了RNA-seq表达量计算的方法,我们主要讨论了两点内容:

(1)表达量不同计算方法间的区别,也就是RPKM、FPKM、TPM的区别。
(2)表达量不同校正方法的区别,主要分享了Deseq软件校正策略背后的逻辑(中位数校正),以及遇到问题数据的时候该如何处理。





在下周(3月16日)的交流中,我们重点讨论后续的差异表达分析。

交流主要内容涉及以下问题:

(1)基础理论介绍
通俗解释表达差异分析背后的基本原理。
为什么在RNA-seq中没有生物学重复,也能实现差异分析的统计。

(2)不同差异分析方法的比较
有生物学重复和无生物学重复,背后的统计策略有何不同
Deseq、cuffdiff等软件差异分析的原理是什么?
为什么不同方法得到的P value值不同
差异分析为什么输入的数据是reads counts,而不是RPKM值

(3)不同方法的实际应用
如果差异分析,结果不显著该怎么办?
为什么方差分析不适合用于差异表达分析。

备注:本次培训的背景知识包括:
(1)序列比对——如何将read比对到参考基因组
(2)Read在基因的表达量分配——多重比对的reads在可变剪切和基因家族间如何分配


报名地址:http://ke.qq.com/course/120303#term_id=100132078




PPT下载(在16日培训完成后最新更新):




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 楼主| 发表于 2016.3.9 14:52:36 | 显示全部楼层
交流视频来了!!  拿走不谢~~

http://www.omicshare.com/class/Home/Index/singlev?id=8
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 楼主| 发表于 2016.3.9 14:52:48 | 显示全部楼层

本次在线交流问答整理如下:

问1:在没有重复实验的情况下,用RPKM要怎么做检验呢?
答:如果要用泊松分布做差异分析模型的话,必须要用reads count的。只有RPKM值的话,可以用RPKM的公式反推reads count数,再做检验。


问2:Deseq是怎么控制reads多重比对的?
答:Deseq只是一个差异分析的软件,多重比对的分配是在Deseq之前的。Deseq是输入的数据是已经分配好的reads count,然后用于分析,但是如果reads 多重比对要怎么处理的,那么要使用reads分配分析软件,例如cufflinks或Rsem软件。所以Deseq是不能处理多重比对的,应该之前用软件进行预处理。一般来说多重比对有两种方案:
1)如果一个reads多重比对的话,可以把多重比对的reads删除掉,
2)使用cufflinks 和 Rsem分配比对结果bam文件;
如果不关心可变剪切的差异,策略1也是合理的。如果关心可变剪切,则建议策略2。

问3:Deseq、edgeR和cuffdiff在处理多重比对reads的时候差别是什么?
答:Deseq与edgeR只是一个差异分析的软件,就是类似于做方差分析的软件一样。但cufflinks是个软件包,从数据比对到reads count 到差异分析都全包了,所以如何处理多重比对的reads是与 Deseq或者edgeR是无关的。可以用cufflinks或者RSEM来做多重比对的处理,然后做差异分析,则可以继续选用 Cuffdiff 、Deseq或 edgeR。


问4:用TMM标准化之后再用基于泊松分布的差异分析算法,计算差异基因靠谱吗?
答:TMM标准化的确是独立的方法。既然有生物学重复就不建议用泊松分布模型。因为TMM是edgeR的归一化算法,建议后续的差异分析继续使用edgeR。泊松分布可以做差异分析,但是这个方法无法估算生物样本之间的个体差异。所以他最后是相当于低估了P值,统计结果是存在较大假阳性。


问5:如果想比较环境对基因表达的差异,分别从两个地区各取三株样品,比较组间差异可以吗?
答:可以。这个方法是可行的,但是有一点,目前我认为RNA-seq最大问题是如果只测三个生物学重复,对模式生物来说还是OK的,比如小鼠、拟南芥,他们个体差异很小。我们知道个体差异本来就是组内差异的一部分。所以对于模式生物来说一开始个体差异是非常小的。但是如果从两个区域取样的话,而且非模式生物学样本,例如林木、昆虫,可能个体差异会比较大,容易得到组间差异不显著的结论。所以想得到一些更稳定的指标的话,建议用混样作为生物学重复来做差异比较将会更加稳定。


用混样作为样本的逻辑是这样的,比如在某个区域取到30个样本,然后把每10个样本混成一个池,比如前十个,中间十个,后面十个,构成三个样本池,这个时候其实这三个样本池还是不一样的。生物学重复本身就是假设是抽样,从一个大样本中抽样,来计算抽样误差多大,如果将个体作为重复的话,这种个体差异比较大,这样就导致抽样误差比较大。但是如果以群体作为样本的话,因为群体的均值更加稳定,得到样本间差异将更小,所以我们才会建议所有样本混合成若干池,这样减少抽样误差。

查看完整问答整理戳这里下载:



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迅猛龙

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发表于 2016.3.10 08:51:11 | 显示全部楼层
期待
早上好!
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钵水母

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发表于 2016.3.10 09:59:57 | 显示全部楼层
期待周老师的课~
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发表于 2016.3.10 10:26:47 | 显示全部楼层
又能够充电了,呵呵
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帝王蝶

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迅猛龙

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发表于 2016.3.10 10:59:15 | 显示全部楼层
新的一天加油!
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发表于 2016.3.11 09:06:21 | 显示全部楼层
期待视屏,需要反复理解学习,周老师的课
你好
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钵水母

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发表于 2016.3.11 10:10:43 | 显示全部楼层
很期待
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帝王蝶

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发表于 2016.3.11 11:35:57 | 显示全部楼层
期待中~
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钵水母

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发表于 2016.3.11 14:53:05 | 显示全部楼层
本帖最后由 蓝海豚 于 2016.3.11 15:02 编辑

我等的花儿都谢了
我等的海儿都枯了
你知道我会永远永远等你给我的回答
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迅猛龙

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发表于 2016.3.11 22:52:50 | 显示全部楼层
新的一天加油!
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钵水母

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发表于 2016.3.12 10:15:42 | 显示全部楼层
期待中。。。
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钵水母

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发表于 2016.4.8 14:58:26 | 显示全部楼层
解决了我一大难题啊
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帝王蝶

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发表于 2016.4.10 14:04:29 | 显示全部楼层
很棒的资料
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发表于 2016.4.11 09:16:57 | 显示全部楼层
哈哈
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学习不止
加油
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钵水母

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发表于 2016.5.13 21:53:59 | 显示全部楼层
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帝王蝶

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发表于 2016.5.22 21:27:59 | 显示全部楼层
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