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[RNA提取] 求教含糖量高的组织的RNA提取

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钵水母

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本帖最后由 自在飞 于 2015-12-8 18:06 编辑

我做的材料是多糖材料(果皮),而且多酚含量很高,用TRIZOL法一直没有结果,求大虾指点啊~~
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 楼主| 发表于 2015.12.8 16:31:41 | 显示全部楼层
我用了专门针对多糖多酚含量高的植物的提取试剂盒,可是最后一步溶解RNA的时候还是特别不好溶,跑胶发现孔里很亮,应该是有多糖杂质,或者蛋白,或者别的,或者都有……
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发表于 2015.12.8 17:38:08 | 显示全部楼层
TRIzol法无法去除糖、酚类物质。建议试一下CTAB提取,先不管降不降解了,先看看能不能提出核酸(DNA和RNA),如果能提取出来,再考虑尽量保持RNA完整性,避免降解,慢慢来。
PS:有些公司所谓的提取多糖多酚类RNA试剂都扯淡,我曾经也被坑过,根本提不出来!
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 楼主| 发表于 2015.12.8 18:02:05 | 显示全部楼层
Flier 发表于 2015-12-8 17:38
TRIzol法无法去除糖、酚类物质。建议试一下CTAB提取,先不管降不降解了,先看看能不能提出核酸(DNA和RNA) ...

我是这么处理的,试验用的玻璃仪器,研钵均在180℃处理4h以上,枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜,高压灭菌烘干后使用。
本人对整个操作过程还是很熟练的,之前提取过叶片和根皮的总RNA都成功了。
请问有具体的实验方法吗?谢谢!
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发表于 2015.12.9 10:43:18 | 显示全部楼层
      建议你试下硫氰酸胍提取方法(仅供参考),硫氰酸胍能溶解细胞并使蛋白变性,当用于抽提缓冲液时,可产生无RNase的环境。组织抽提后,以中等转速离心匀浆液,以除去不溶性多糖。用苯酚/氯仿将上清液抽提出,RNA位水相,DNA和蛋白质位于苯酚相和两相交界面。用醋酸钾将位于水相的多糖选择性的沉淀出来。然后用氯化锂选择性将RNA从残余的污染物中纯化出来。


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发表于 2015.12.9 10:44:52 | 显示全部楼层
自在飞 发表于 2015-12-8 18:02
我是这么处理的,试验用的玻璃仪器,研钵均在180℃处理4h以上,枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜,高压 ...

(一)材料与设备
1.        0.75mol/L 柠檬酸钠,pH 7.0 (含柠檬酸)。用0.1% DEPC处理并高压灭菌。
2.        10% (w/v) N-月桂肌氨酸(N-lauroyl sarcosine)。
3.        硫氰酸胍缓冲液:用293 ml无菌去离子水,17.6ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠,26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸钠,在厂家药瓶内于65℃溶解250g 硫氰酸胍(不用称重)。
4.        抽提缓冲液:每5ml 硫氰酸胍缓冲液加36µl 巯基乙醇。若被提取组织含多聚苯酚,抽提缓冲液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrolidone)(20% w/w)。
5.        氯仿/异戊醇49:1(v/v)。
6.        2 mol/L 醋酸钠,加乙酸至pH 4.0 。
7.        酸性苯酚:500g 晶体苯酚溶于500ml去离子水中,50ml每份于-20℃保存,4℃可保存一个月。
8.        异丙醇。
9.        70%和100%乙醇。
10.        2 mol/L 醋酸钾,加冰醋酸至pH 4.8。
11.        1O mol/L LiC1。
12.        TNE 缓冲液:10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 室温, 150mmol/L NaC1, 1 mmol/L EDTA。
13.        TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 1mmol/L EDTA。
14.        研钵和研杵。
15.        液氮。
16.        离心机。
17.        玻璃Pasteur 吸量管,200℃干烤至少3小时。

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发表于 2015.12.9 10:46:03 | 显示全部楼层
自在飞 发表于 2015-12-8 18:02
我是这么处理的,试验用的玻璃仪器,研钵均在180℃处理4h以上,枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜,高压 ...

(二)操作方法
1.        在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末,勿让组织解冻。
2.        在研磨过程中,加入3.5ml抽提缓冲液,充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管。用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵,然后移至聚丙烯管中。
3.        23000g,4℃,离心20 分钟。
4.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入10ml 聚丙烯管。
5.        加0.4ml 2mol/L 醋酸钠,混合混匀。加4ml苯酚,混匀。加0.8ml氯仿/异戊醇,混匀。
6.        聚丙烯管置于冰上 15 分钟。
7.        离心,方法如步骤3。
8.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml 聚丙烯管,加入同样容积的         2mol/L 醋酸钾,混合混匀。
9.        聚丙烯管置于冰上至少30 分钟。
10.        44000g,4℃离心20 分钟。
11.        将上清液移入15ml 聚丙烯管,加0.6-1 倍体积的100%的冰异丙醇,混匀,-20℃ 放置45 分钟。
12.        以2700g,于4℃离心20 分钟。
13.        轻轻倒出上清液,用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀,如步骤12离心3 分钟,尽可能将乙醇倒净。
14.        加入400µl DEPC 处理的水溶解沉淀,移至1.5ml管中。
15.        加100µl 10mol/L LiC1, 4℃ 放置至少2 h。
16.        12000g,4℃离心20 分钟 。
17.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
18.        加入200µl TNE 重悬沉淀,再加500µl 100% 乙醇,-20℃ 放置至少15 分钟。
19.        如步骤16离心5分钟 。
20.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
21.        加入200-400µl TE 重悬沉淀。
22.        将每个样本稀释30-50倍,在 230nm,260nm,280nm测量吸光度。
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发表于 2015.12.9 10:46:45 | 显示全部楼层
最后是注意事项
1.        开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖,如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀(若用的是叶子),不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层。
2.        当吸取上清液时,应十分小心,勿搅乱胶状沉淀,因为该层非常软。上清液的体积大约4 ml,若因沉淀多而使体积明显不足时,用抽提缓冲液补足。
3.        加入乙酸钾后,延长孵育时间(达30 分钟)会提高 RNA 的质量,尤其出现蛋白污染时。多糖形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量高,延长孵育时间(至60 分钟)也有助于沉淀更多的多糖。
4.        加入异丙醇后,不应看到沉淀,任何可见的沉淀表明大量多糖的存在。孵育时间大于60 分钟,就会形成多糖沉淀。
5.        RNA 沉淀应为白色,若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况,将沉淀再悬浮于200µl TE,加1倍体积的2mol/L 醋酸钾,冰上孵育30 分钟。12,000g ,4℃离心 20 分钟。将上清液移至一新1.5ml 管中,用2.5 倍体积的100% 乙醇沉淀RNA,-20℃,15 分钟. 继续方法中的步骤16。
6.        判断RNA分离的成功与否,测量在230,260,280nm处的紫外吸收可以评估RNA的产量和质量。若A260/230值小于2,则表明多糖和/或多聚苯酚污染;若A260:A280比值小于1.7,表明蛋白污染。在琼脂糖凝胶上出现的28S和18S rRNA,可用以评估RNA的完整性。
7.        该方法提取的RNA适于poly(A)+的分离,Northern 分析,cDNA 分析,RT-PCR扩增。

仅供参考,希望对你有所帮助,:lol

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小瑶 + 5 这么长……码字不容易

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 楼主| 发表于 2015.12.10 09:45:40 | 显示全部楼层
基迪奥—何德飞 发表于 2015-12-9 10:46
最后是注意事项
1.        开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖,如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗 ...

好详细,非常感谢,回头我去试试。
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发表于 2015.12.10 10:56:43 | 显示全部楼层
基迪奥—何德飞 发表于 2015-12-9 10:46
(二)操作方法
1.        在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末,勿让组织解冻。
2.        在研磨过程中, ...

好专业呀!!
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发表于 2015.12.19 09:31:13 | 显示全部楼层

正好之前给一个客户整理过。
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来领奥币的额,抱歉啦
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发表于 2016.4.25 15:13:34 | 显示全部楼层
不错,很详细的方法
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建议试试全是金的植物RNA提取试剂盒
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发表于 2016.4.27 14:45:44 | 显示全部楼层
我们用的是百泰克的,感觉还不错!你也可以试试......
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.5.3 22:05:19 | 显示全部楼层
王启超 发表于 2016.4.27 14:45
我们用的是百泰克的,感觉还不错!你也可以试试......

哦,你提的是什么组织?
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帝王蝶

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发表于 2016.5.5 08:39:43 | 显示全部楼层
自在飞 发表于 2016.5.3 22:05
哦,你提的是什么组织?

我提的是叶片,不过也是多糖多酚,可能比你的少点
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学习了,谢各位大虾
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迅猛龙

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学习了!
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