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多肽系列之如何验证sORFs编码的多肽?

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    发表于 2019.5.14 09:42:33 | 显示全部楼层 |阅读模式
    前面三期我们分别介绍了利用生物信息分析的方法来挖掘潜在可能编码多肽的sORFs(具体请戳这里)、然后利用翻译组ribo-seq的方法寻找sORFs的翻译证据(具体请戳这里)、再然后利用基于质谱技术的多肽组学进行sORFs编码的小分子多肽(SEPs)的直接检测(具体请戳这里)。

    那么,找到SEPs后,要如何验证这些小肽的真实存在呢?又如何开展下游的功能与机制研究呢?今天我们就跟大家详细介绍一下。

    SEPs的验证方法

    1. 合成目标肽段,质谱验证


    体外合成目标SEPs,利用串联质谱技术(MS/MS)来验证内源性多肽的存在。例
    如下图,出自2012年发表在《Nature Chemical Biology》上的一篇文章[1],上图是人工合成的多肽的二级谱图,下图是用样本打质谱得到的内源性多肽的二级谱图。可以发现两张谱图的碎片离子是一模一样的,证明了该内源性多肽的真实存在。


    2. 保守性分析


    我们之前在“利用生物信息分析的方法来挖掘潜在可能编码多肽的sORFs”时有提到过可以分析序列的保守性、编码能力来判断一个sORF是否可能编码成多肽。实际上,很多文章中在找到了目标SEPs后会再对其进行编码能力的分析、不同物种间的保守性分析,来证明该sORF确实很大可能编码了一个多肽。


    我们可以利用PhyloCSF软件来进行lncRNA编码能力的分析。PhyloCSF是一个预测基因序列是否具有蛋白编码能力的软件,利用CSF (codon substitute frequence,密码子替换频率)分值来区分蛋白编码区和非编码区。PhyloCSF以score值来评估lncRNA的编码性,score值为正则表示保守编码区,score值为负则表示非编码区。例如2014年的science文章,目标多肽toddler的序列PhyloCSF score值为98,说明该序列氨基酸具有强烈的保守性[2]。


    另外,将目标小肽的氨基酸序列与其他不同物种的同源序列进行多序列比对,也是常用的评估序列保守性的方法。例如下图,也是来自2014年的science文章,将目标斑马鱼多肽toddler与人、小鼠、鸡等不同物种的同源序列进行多序列比对,可以发现序列保守性非常强,特别是C端11aa的一段序列[2]。


    3. 制备多克隆抗体,验证目标多肽的内源表达


    针对目标小肽的序列特征,体外制备多克隆抗体,然后进行western blot验证目标小肽的内源性表达,这是验证目标小肽的最有力的证据之一。例如2016的science文章,针对目标多肽DWORF的N端12个氨基酸制备了兔源多克隆抗体,然后利用western blot检测DWORF在不同组织中的表达情况,结果显示在预期的3.8kD处有一条清晰的条带,并且只在比目鱼肌中检测到了,而在其他组织中没有任何条带的检出[3]。


    另外,制备好的多克隆抗体也可以用于后续的功能实验,所以性价比还是挺高的。


    4. 在目标序列上插入flag标签序列或GFP序列

    这是最常用的方法。在目标序列上插入flag标签序列或GFP(绿色荧光蛋白)序列,构建表达载体,然后将表达载体转染细胞,通过免疫印迹、免疫荧光等实验验证ORF的翻译。


    通过构建重组表达载体,不仅可以证明该小肽表达了,还可以进行小肽的亚细胞定位。如上面提到的来自2014年的science文章中,作者构建了两种GFP融合蛋白,一个是野生型的Toddler加上GFP序列,一个是突变了信号肽切割位点的Toddler加上GFP序列。结果显示野生型的Toddler在细胞外表达,而信号肽切割位点突变型的GFP融合蛋白则保留在细胞中,证明了Toddler是一个信号肽,主要在细胞外发挥生物功能[2]。



    SEPs的功能研究方法

    研究SEPs在生物体内行使的功能,首先我们要证明是蛋白本身行使功能,而不是mRNA本身。那么怎么证明呢?

    同样以2014年的science文章来举例。文章采用了两个方法来证明是蛋白本身行使功能:


    (1)体外注射人工合成的Toddler小肽,与过表达其mRNA获得的gain-of-function表型相同;


    (2)导入表达野生型mRNA序列可以恢复敲除突变体的表型,但导入移码突变序列则没有效果,这直接证明了Toddler是通过翻译成蛋白行使功能,而不是RNA本身。


    这些方法都能充分证明了是sORF翻译成的蛋白行使着生物学功能,而不是RNA本身。证明了这一点后,我们就可以放心地进行SEPs的功能机制研究了。SEPs的功能机制研究方法,跟其他目标基因或蛋白的功能机制研究方法一样,也是敲除与过表达、体内细胞实验和体外模式小鼠实验等。这里就不一一展开陈述了。

    一般来说,完整的研究除了目标基因或蛋白的挖掘和验证,还需要阐明目标基因或蛋白在细胞内行使的功能以及其分子机制,这也是低分文章与高分文章的区别。对于sORF编码的多肽研究,如果能够做到上面所提到的多肽验证、多肽功能与机制研究,那么发5-10分的文章一般没什么问题。下面我们就来解读一篇Cell Reports(IF: 8.032)的文章,看别人是怎么完整地讲故事的:

    文章题目:lncRNA编码的小肽Mitoregulin增强了线粒体功能[4]

    文章首先从人类lncRNA表达数据中鉴定到一个在骨骼肌和心脏富集的lncRNA-LINC00116,发现其编码了一个高度保守的56个氨基酸的小肽mitoregulin (MtIn)。

    文章从三个方面验证了LINC00116可编码成MtIn小肽:

    (1)Ribo-seq数据支持LINC00116主转录本的第一个外显子在人和小鼠细胞系和组织中翻译活跃;


    (2)信息分析(Phobius and TMHMM algorithms)发现在不同物种中该区域都可能潜在编码一个高度保守的56aa的单跨膜小肽。


    (3)制备C端的多克隆抗体,western blot验证。结果显示在心脏、骨骼肌和脂肪组织中10kDa处有一条清晰的条带,而其他组织没有。


    文章接下来利用flag-tag/GFP表达载体、在人HeLa细胞中过表达或siRNA沉默、CRISPR/Cas9敲除小鼠等技术实验,研究了MtIn小肽的功能。发现MtIn定位在线粒体内膜上,结合心磷脂,影响了蛋白复合物的装配。


    在人HeLa细胞中过表达Mtln增强了线粒体的功能,如增强了线粒体膜电势、呼吸效率和钙离子储存能力,降低了线粒体ROS和基质游离钙离子浓度。在人HeLa细胞中沉默Mtln则降低了线粒体膜电势并伴随线粒体ROS的升高。在小鼠中敲除Mtln则影响了线粒体呼吸复合物形成和活性、脂肪酸氧化、TCA循环和钙离子储存能力。



    文章最后还研究了Mtln增强线粒体功能的分子机制。在Mtln-KO心脏和骨骼肌组织中进行Blue Native PAGE电泳,结果显示Mtln与一些蛋白复合物一起迁移,包括组装复合物I、复合物V和超级复合物。


    在变性条件下(SDS-PAGE),Mtln仍然与大分子量蛋白复合物结合,说明了Mtln通过粘性分子的作用促进了蛋白复合物的装配并增强了其稳定性,从而增强了线粒体呼吸效率。


    好了,关于sORFs编码多肽的干货知识,今天就全部介绍完了,希望能给到大家一点科研的灵感和帮助~~如果大家刚好有需要研究的多肽,请联系我们基迪奥的销售人员,我们会为您提供优质的测序与分析服务!



    拓展阅读
    多肽的种类与生物学功能
    sORF编码的功能多肽来自哪里?
    如何鉴定sORFs编码多肽?(1)
    如何鉴定sORFs编码多肽?(2)
    如何鉴定sORFs编码多肽?(3)


    参考文献:
    [1] Slavoff S A , Mitchell A J , Schwaid AG , et al. Peptidomic discovery of short open reading frame–encoded peptides inhuman cells[J]. Nature Chemical Biology.
    [2] Pauli A , Norris M L , Valen E , et al.Toddler: An Embryonic Signal That Promotes Cell Movement via ApelinReceptors[J]. Science, 2014, 343(6172):1248636-1248636.
    [3] Nelson B R , Makarewich C A , AndersonD M , et al. A peptide encoded by a transcript annotated as long noncoding RNAenhances SERCA activity in muscle[J]. Science, 2016, 351(6270):271-275.
    [4] Stein C S , Pooja J , Xiaoming Z , etal. Mitoregulin: A lncRNA-Encoded Microprotein that Supports MitochondrialSupercomplexes and Respiratory Efficiency[J]. Cell Reports, 2018,23(13):3710-3720.e8.

    本文作者:基迪奥-小师妹

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