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[转录组] 好忧桑!qPCR验证与转录组测序结果不一致

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发表于 2016.4.12 16:34:21 | 显示全部楼层 |阅读模式

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看到这个题目就好忧桑dèi不dèi。经常有很多人问这个问题,比如某个同学就挑了一堆(20个)基因用qPCR做验证,然后只有1个基因的表达量上下调趋势与qPCR验证结果一致,也是醉了……怎么办?莫慌,作为一个有节操的小编,我们是会告诉大家怎么解决的。

我们先来分析一下两者不一致的原因有哪些。

1.原因可能有:
1)样品对比关系搞反了(A vs B);
这个需要对照测序公司的原始数据,查看结果,比如某个基因的差异倍数的表头写着A vs B ,那么就是B除以A。

2)没有用同一批样品来检验;
这点很重要,不用问什么,大家照做就好了……

3)样品有污染、核糖体污染——转录组的基因表达量计算有误;
一般来说,在计算转录组测序基因表达量的时候,都要求去掉核糖体的。

4)做QPCR验证的基因表达量偏低,差异不显著;
这点也很重要,也不要问为什么,因为用表达量很低的基因做验证, 并没什么卵用~

5)两种方法本身存在差异,出现不一致情况也正常(40%左右)。
我们认为在一定情况下,出现不一致也属正常;然后这个具体要看审稿人什么意见,再做解释……哈哈

2.相应的解决办法有

1)检查样品对比关系有无搞反;

2)用同一批样品来做转录组和QPCR;

3)排除样品污染;
比如核糖体污染、真菌样品的排除细菌污染等;

4)尽量挑选差异显著的基因,表达量不能太低;

5)排除了以上所有可能后,结果还不一致的话,先检查QPCR结果是否正确,比如只是挑了一个基因的话,如果你确定QPCR没有问题的,那就以他为准。如果你挑了20个基因,结果都不一致的话,那要看下测序数据的分析是否有无问题。然后同时检查老师预期是否有误。



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中华鲟

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发表于 2016.4.13 10:00:34 | 显示全部楼层
出现不一致的就不要了

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……  发表于 2016.4.13 16:23
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帝王蝶

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发表于 2016.4.13 21:06:25 | 显示全部楼层
取决于分析方法的假阳性高低
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中华鲟

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发表于 2016.4.14 10:18:09 | 显示全部楼层
验证了15个,其中一个差异不显著,照样放在稿子里了····
希望审稿人手下留情
拖延症患者
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 楼主| 发表于 2016.4.14 10:38:57 | 显示全部楼层
开挂 发表于 2016.4.14 10:18
验证了15个,其中一个差异不显著,照样放在稿子里了····
希望审稿人手下留情
...

God bless you~
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中华鲟

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发表于 2016.4.14 12:24:41 | 显示全部楼层

小瑶保佑我吧
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 楼主| 发表于 2016.4.14 16:03:35 | 显示全部楼层

小瑶要保佑的人有点多啊
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中华鲟

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发表于 2016.4.14 21:26:57 | 显示全部楼层
小瑶 发表于 2016.4.14 16:03
小瑶要保佑的人有点多啊

自古以来就是能者多劳啊!
拖延症患者
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草履虫

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发表于 2016.4.14 21:50:09 | 显示全部楼层
一般转录组的文章做多少验证合适?
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帝王蝶

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发表于 2016.4.19 02:26:02 | 显示全部楼层
楼主分析不错,学习了
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帝王蝶

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发表于 2016.4.19 08:47:28 | 显示全部楼层
如何验证差异显著不显著?是用三次荧光定量重复的数据吗?
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帝王蝶

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发表于 2016.4.19 08:53:17 | 显示全部楼层
好吧,照做就好了,最好是别出问题
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发表于 2016.4.19 11:38:13 | 显示全部楼层
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钵水母

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发表于 2016.4.22 09:07:02 | 显示全部楼层
不错,学习了
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帝王蝶

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发表于 2016.4.22 10:14:20 | 显示全部楼层
luna 发表于 2016.4.19 08:47
如何验证差异显著不显著?是用三次荧光定量重复的数据吗?

我自己做的时候,是重复能多做则多做,一次做6个重复,从出来的结果里面选最好的去做差异分析。简单粗暴又高效。
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钵水母

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发表于 2016.4.22 13:32:41 | 显示全部楼层
看了很担心啊。。。我的也正在做。。。也怕不一样啊。。。
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 楼主| 发表于 2016.4.22 13:59:40 | 显示全部楼层
北轩小陌 发表于 2016.4.22 13:32
看了很担心啊。。。我的也正在做。。。也怕不一样啊。。。 ...

这位同学,心态要积极点~
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帝王蝶

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钵水母

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小瑶 发表于 2016.4.22 13:59
这位同学,心态要积极点~

我非常想积极啊。。。。
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帝王蝶

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发表于 2016.9.7 02:27:50 | 显示全部楼层
可以用IGV看看有些是不是mismapping
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