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做肠道转录组发Science案例分享

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    发表于 2018.2.2 10:52:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
    今天跟大家分享一篇哈佛医学院发表在上上期Science上微生物互作机制研究的论文,下面就来看看作者是怎么讲故事的吧。
    首先我们大家都知道细菌具有6大类分泌系统(截止目前,后面不知道会不会发现更多),按其分泌是否利用Sec转位酶可分为两大类:一类是利用Sec转位酶(translocase)和N末端信号序列进行蛋白转运的,包括II型(T2SS)和V型分泌系统(T5SS);另一类则不依赖Sec转位酶,如I型(T1SS)、Ⅲ型(T3SS)、IV型(T4SS)和VI型分泌系统(T6SS)。本文研究的对象就是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的T6SS。

    提出假设

    霍乱弧菌的T6SS可以在体外杀死异源细菌,如大肠杆菌(Escherichia coli),但是它在体内(在被感染的实验动物体内)被激活来杀死对其毒性效应物缺乏免疫力的霍乱弧菌细胞。

    实验论证

    实验1:霍乱弧菌T6SS的作用

    对照Buffer(无霍乱弧菌,No Vc),野生型霍乱弧菌(Vc WT),vipA基因缺失的T6SS缺陷型菌株(Vc T6SS-)感染小鼠,然后在不同时间点(8,12,18,24h)收集小肠(SI)匀浆后进行菌落计数(CFU是colony forming units,菌落形成单位,是常见的细菌数目检测单位)。

    从图A可以看出,弧菌的共生菌E.coli 在有野生型弧菌接种后大幅度减少,说明WT弧菌杀灭了E.coli 。同时,T6SS缺陷的弧菌对E.coli 的杀伤效果不明显,野生型的杀伤效果比缺陷型高300倍。由此很容易得出结论:弧菌杀伤共生的E.coli 主要是依靠T6SS。图B得出一个结论,T6SS缺陷的弧菌不易在小鼠肠道定殖,由此引发思考,难道T6SS和细菌的定殖有关?(细菌能否定殖和在何处定殖决定了细菌的致病性及致何种病,对于病原微生物来说定殖能力非常重要)然后作者再做了一个实验,把野生型和突变型同时接种到小鼠体内,发现野生型可以促进缺陷型菌株的定殖,进一步证实了T6SS和定殖能力相关。



    实验2:小鼠对弧菌响应的转录机制研究

    用野生型和突变型弧菌处理小鼠6,10,14,22h后取肠道进行转录组和qPCR实验,重点关注il6(白细胞介素6)和KC(趋化因子)两个基因的表达情况。发现在6h,野生型是突变型的3.3倍和5.1倍(图A,图B)。这些结果表明,在感染早期,先天性免疫因子IL-6和KC的诱导依赖于具有活性T6SS的霍乱弧菌
    到这里问题又来了,虽然观察到了免疫反应,但是这个现象是怎么导致的?会不会是因为弧菌杀死了其他共生菌(前一个实验结论)导致的?

    所以为了研究的严谨性和完整性,再做实验,我先用抗生物(链霉素SM)把小鼠体内其他的菌杀死,再用弧菌去感染,这下圆满了。在不存在链霉素敏感的肠道共生物的情况下,在感染野生型霍乱弧菌的小鼠和感染T6SS突变株的小鼠之间,在6小时时没有观察到IL-6或KC表达水平的显着差异(图C)。

    那么接下来我再做个RNA-seq和qPCR,这135个差异基因只可能是T6SS缺失与否造成的了。图D展示了和宿主免疫反应相关的基因表达模式,重点关注转录因子NF-kB通路和再生胰岛蛋白3γ和β。作者得出结论:野生型霍乱弧菌比T6SS突变体更能诱导先天免疫反应。



    实验3:T6SS对疾病(腹泻)的影响

    这个实验首先还是用野生型和突变型弧菌饲喂小鼠,检测腹部积液(腹泻的指标),发现野生型比缺陷型更厉害,而用抗生素处理之后,效果就不明显了,进一步说明T6SS是通过杀死其他共生菌来导致疾病的。

    再进一步,对抗生素SM处理和不处理的霍乱弧菌进行转录组研究,发现毒力操纵子ctx和tcp 的表达差异:在早期,野生型的均高于缺陷型,但是抗生素处理之后差异显著下降。又结合细菌的体外培养,T6SS处理的大肠杆菌ctx和tcp的转录被激活。因此得出结论:宿主驱动T6SS依赖的毒力基因表达变化。



    实验4:不同霍乱流行期间病原菌的转录差异

    将过去的七次流行病El Tor菌株N16961(1971)和 C6706(1991)的转录组和最近的变异菌株MDC126(2008)和H1(2010)染色体I和II的T6SS相关操纵子发生变异)的转录组进行比较分析。从图中可以看出,突变株具有更高的表达量(这里直接使用RPKM值进行作图比较)。



    提出模型

    总结以上的实验结果,推导出结论:霍乱弧菌,原生肠道共生菌和宿主之间相互作用的模型。



    当霍乱弧菌到达小肠上皮时,“感觉到”来源于其环境(腔或粘液层)的未知信号1以激活其T6SS的表达。霍乱弧菌然后杀死T6SS敏感的共生生物排列肠道上皮,从而清除自己的适应空间和营养获得。
    来源于裂解共生体的细菌碎片充当新的信号2,其诱导上皮中的先天性免疫应答,并且导致作为宿主来源的信号3的粘膜环境的变化,其激活V的表达。霍乱毒素(CT)等霍乱毒力因子,以及肠道定殖因子毒素共同调节菌毛(TCP)。先天性免疫应答和CT对粘膜上皮的作用均导致疾病症状(即腹泻)的升高,霍乱弧菌传播增加以及增加作为人类病原体的适应性。

    总    结

    这篇论文回答了一个微生物学界的重要问题:微生物之间的互作,微生物与宿主的互作。以前认为微生物都是独立的个体,近年来才发现微生物往往是抱团发挥作用,最典型的的莫过于群体感应(QS)系统。

    这篇文章从霍乱弧菌的T6SS系统出发,一步一步设计实验(严格对照实验),只用了简单的菌落计数,RNA-seq和qPCR等手段,就对前人的假设进行了验证,并且进一步揭示了现象背后的机制,最后构建一个新的模型。这是大多数高分文章的思路。

    TIPs:可以看出,转录组测序已成为一种常规的实验手段,基迪奥生物有丰富的转录组项目经验,且为客户量身定制个性化的多组学解决方案,且合作客户已有多篇高分文章发表,感兴趣的老师同学可以给我们留言。

    今天的内容就到这里啦~

    参考文献:Zhao, Wenjing, et al. "Antagonism toward the intestinal microbiota and its effect on Vibrio cholerae virulence." Science 359.6372 (2018): 210-213.           

    作者:基迪奥 技术咖


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