查看: 3914|回复: 21

[ChIP-seq] 给大家分享一下ChIp实验的心得体会~~

  [复制链接]
  • TA的每日心情

    2016.9.21 09:09
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    13
    奥币
    1624
    积分
    200
    注册时间
    2015.11.23
    在线时间
    31 小时

    发表于 2015.12.9 10:12:21 | 显示全部楼层 |阅读模式
    最近发现很多人在实验设计的时候脑子短路了,然后就没有然后了……我一直秉着为大家排忧解难的宗旨,今天特别跟大家分享这篇ChIP项目的心得体会,希望对大家有帮助~

    染色质免疫沉淀(ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。虽然ChIP技术的原理不复杂,但是对技术的要求高,实验步骤的设计摸索耗时耗力,实验耗费时间长。
    要成功实施ChIP项目,请明确下面4个问题~

    1、是否需要交联
    交联的目的是将感兴趣的抗原固定在其染色质结合位点。如果没有交联的步骤,就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀,譬如组蛋白。如果您的研究对象是组蛋白,那可能不需要交联,而其他蛋白,如转录因子和DNA结合复合物中包含的蛋白,可能还需要交联。

    如果使用交联,那么ChIP反应被称为X-ChIP,如果是天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而,确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式,因为在交联过程中它们的表型会发生变化,或出现包涵体。



    2、片段化要小心
    染色质必须片段化,才能让相互反应接触到抗体。无论您采用哪种方法,都必须确保一定的片段化时间进程。对于X-ChIP,超声波处理是必需的,因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化,不过说明书上通常都会给出一个参考条件。超声波产生了随机的DNA片段(平均500-700 bp)。在开展N-ChIP时,微球菌核酸酶的消化可产生~175 bp的单体。酶切消化的优势在于消化的重复性好,易控制反应。

    3、抗体用对没有
    如果可以的话,使用经过充分验证、ChIP级别的抗体。当然,这种抗体并不多。如果没有,也可以选择普通的免疫沉淀抗体,或能够识别天然表位的抗体。一般来说,多克隆抗体是个更好的选择,因为单克隆抗体只识别单个表位,而这个表位有可能在交联过程中被掩盖。而另一方面,单克隆抗体却往往有着更好的批间一致性。抗体的量和使用的条件都应根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ug DNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。


    4、对照也很重要
    作为ChIP技术的阳性对照,H3K4me3和H3K9me3分别适用于激活和失活的基因。作为阴性对照,可选择一个识别非染色质表位的抗体,如GFP抗体。但要记住,这些抗体本身不是阳性和阴性对照,因为这取决于您正在研究的位点。如果在您研究的位点无H3K4me3,即使是最好的ChIP级别的H3K4me3抗体也不能让任何东西免疫沉淀,那么这就不是一个理想的阳性对照。如果您的实验室刚刚开始用ChIP,最好考虑购买试剂盒。
    (转自生物通)


    大家有什么实验体会也一起交流一下。




    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x

    评分

    参与人数 1奥币 +5 贡献 +2 收起 理由
    小瑶 + 5 + 2 很给力!

    查看全部评分

    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.3.3 14:52
  • 签到天数: 33 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    7
    奥币
    692
    积分
    116
    注册时间
    2015.11.24
    在线时间
    15 小时

    发表于 2015.12.9 10:36:32 | 显示全部楼层
    手动点赞
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    忙~
    2019.1.23 23:11
  • 签到天数: 104 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    45
    奥币
    5323
    积分
    4908
    注册时间
    2015.12.5
    在线时间
    500 小时

    活跃会员论坛元老


    发表于 2015.12.9 14:08:13 | 显示全部楼层
    必须点赞!
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.10.21 09:23
  • 签到天数: 87 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    版主

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    17
    奥币
    97006
    积分
    1140
    注册时间
    2015.12.7
    在线时间
    145 小时

    优秀版主


    发表于 2015.12.12 10:28:23 | 显示全部楼层
    虽然我不做实验了,但也必须点赞!想起以前读书时被实验虐的啊~~~~
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.1.20 10:03
  • 签到天数: 12 天

    连续签到: 1 天

    [LV.3]偶尔看看II

    草履虫

    Rank: 2

    主题
    0
    奥币
    458
    积分
    34
    注册时间
    2015.12.17
    在线时间
    2 小时

    发表于 2015.12.25 17:38:11 | 显示全部楼层
    美滋滋的,好受教
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.4.25 23:41
  • 签到天数: 54 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    2
    奥币
    910
    积分
    76
    注册时间
    2015.12.7
    在线时间
    16 小时

    发表于 2015.12.25 18:14:23 | 显示全部楼层
    楼主你介绍了阳性对照,能介绍下阴性对照和Input对照吗?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.5.13 22:32
  • 签到天数: 17 天

    连续签到: 1 天

    [LV.4]偶尔看看III

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    7
    奥币
    1221
    积分
    214
    注册时间
    2015.12.29
    在线时间
    24 小时

    突出贡献论坛元老


    发表于 2016.1.19 20:20:15 | 显示全部楼层
    大哥,我自己手动配试剂都做出来了,只是抗体的级别高点,最好把实验过程放在上面
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.9.21 09:09
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    13
    奥币
    1624
    积分
    200
    注册时间
    2015.11.23
    在线时间
    31 小时

     楼主| 发表于 2016.1.20 09:11:37 | 显示全部楼层
    taojun7054602 发表于 2016.1.19 20:20
    大哥,我自己手动配试剂都做出来了,只是抗体的级别高点,最好把实验过程放在上面 ...

    @基迪奥小师妹
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.10.21 09:23
  • 签到天数: 87 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    版主

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    17
    奥币
    97006
    积分
    1140
    注册时间
    2015.12.7
    在线时间
    145 小时

    优秀版主


    发表于 2016.1.20 18:00:10 | 显示全部楼层

    没做过chip实验……
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    吃饭
    昨天 22:27
  • 签到天数: 1097 天

    连续签到: 1 天

    [LV.10]以坛为家III

    功夫熊猫

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    1
    奥币
    18213
    积分
    3513
    注册时间
    2016.4.25
    在线时间
    781 小时

    灌水之王


    发表于 2016.5.2 13:45:00 来自手机 | 显示全部楼层
    学习,点赞
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.6.2 09:56
  • 签到天数: 2 天

    连续签到: 1 天

    [LV.1]初来乍到

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    0
    奥币
    381
    积分
    73
    注册时间
    2016.5.30
    在线时间
    1 小时

    发表于 2016.5.31 08:26:36 | 显示全部楼层
    谢谢分享
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    吃饭
    6 天前
  • 签到天数: 928 天

    连续签到: 1 天

    [LV.10]以坛为家III

    迅猛龙

    Rank: 8Rank: 8

    主题
    0
    奥币
    6036
    积分
    1057
    注册时间
    2016.3.16
    在线时间
    244 小时

    发表于 2016.6.6 10:22:12 | 显示全部楼层
    好心人呀
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    yes!
    前天 09:05
  • 签到天数: 726 天

    连续签到: 1 天

    [LV.9]以坛为家II

    中华鲟

    Rank: 5Rank: 5

    主题
    7
    奥币
    2646
    积分
    947
    注册时间
    2016.4.8
    在线时间
    319 小时

    最佳新人


    发表于 2016.6.29 09:38:55 | 显示全部楼层
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    吃饭
    2018.5.4 14:25
  • 签到天数: 609 天

    连续签到: 1 天

    [LV.9]以坛为家II

    版主

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    52
    奥币
    5990
    积分
    1270
    注册时间
    2016.1.8
    在线时间
    273 小时

    突出贡献优秀版主论坛元老


    发表于 2016.7.31 17:07:25 | 显示全部楼层
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    no
    2018.4.2 15:49
  • 签到天数: 54 天

    连续签到: 2 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    14
    奥币
    948
    积分
    276
    注册时间
    2016.5.6
    在线时间
    28 小时

    发表于 2016.9.8 18:06:08 | 显示全部楼层
    {:8_414:}
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    吃饭
    2018.6.27 18:43
  • 签到天数: 101 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    7
    奥币
    695
    积分
    248
    注册时间
    2016.9.5
    在线时间
    67 小时

    发表于 2016.9.21 17:45:06 | 显示全部楼层
    学习,点赞
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    yes!
    2018.7.11 09:29
  • 签到天数: 122 天

    连续签到: 1 天

    [LV.7]常住居民III

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    34
    奥币
    1383
    积分
    434
    注册时间
    2016.5.12
    在线时间
    105 小时

    发表于 2016.12.29 14:18:22 | 显示全部楼层
    我想知道Chip 的试剂盒由什么东西,由什么好处?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.23 12:53
  • 签到天数: 2 天

    连续签到: 1 天

    [LV.1]初来乍到

    草履虫

    Rank: 2

    主题
    0
    奥币
    186
    积分
    15
    注册时间
    2017.1.5
    在线时间
    1 小时

    发表于 2017.1.5 13:22:50 | 显示全部楼层
    Great
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    吃饭
    2018.6.27 18:43
  • 签到天数: 101 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    7
    奥币
    695
    积分
    248
    注册时间
    2016.9.5
    在线时间
    67 小时

    发表于 2017.2.3 03:10:12 | 显示全部楼层
    50ug DNA 好多,是必须经过纯化吗?楼主有没有从直接从细胞或组织开始经验?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.11.23 16:01
  • 签到天数: 8 天

    连续签到: 1 天

    [LV.3]偶尔看看II

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    1
    奥币
    502
    积分
    67
    注册时间
    2016.3.20
    在线时间
    4 小时

    发表于 2017.5.15 12:58:55 | 显示全部楼层
    对照有没有试过Mock ?
    ****
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    快速回复 返回顶部 返回列表