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[文献解读] 基迪奥合作客户文章 |小RNA揭示血管平滑肌细胞损伤修复机制

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    发表于 2019.3.6 09:20:54 | 显示全部楼层 |阅读模式
                                                                            


    发表期刊:Journal of Clinical Investigation影响因子:13.251
    合作单位:广州市妇女儿童医疗中心

    我们在做研究的时候,有时候会发现自己做的实验结果和广为人知的结论不太一样,这个时候就会产生自我怀疑,是不是哪里实验出问题了,是不是处理和对照做反了,等等一系列的灵魂拷问。

    但有时候我们可以换种思路,是不是在实验的过程中存在某些未知的调控机制,但这些机制我们还没有发现,因此得出了与预期不符合的结果呢。那么这个未知的调控机制该如果研究呢,我们将用一篇基迪奥客户的文章来进行解答。


    文章概要

    当我们的血管受到损伤时,最初的反应是维持凝块形成、血管收缩和细胞增殖从而止血,这种即时反应主要由血栓素和PDGF等物质介导,这些物质是从活化的血小板中释放,并促进VSMC(血管平滑肌细胞)去分化。

    但当损伤修复后,VSMC的去分化不减弱就会发生大量的内膜增生,因此又需要预防过渡修复(即将VSMC切换回分化的静止状态)。血管损伤的修复和预防过度修复的过程涉及VSMC去分化和分化。

    作者从免疫荧光技术、荧光素酶报告实验、Western blot实验、miRNA测序等多种方法全面的进行了研究,发现miR-223通过下调PDGFRβ基因从而抑制VSMC的脱分化,将脱分化的状态转为分化,解释了VSMC的损伤修复机制。

    实验方法

    血管平滑肌细胞(VSMC)空白组,与血小板共培养的处理组,每组三个重复进行miRNA测序。

    研究思路

    作者通过发现与预期不符的结果,提出miRNA可能在其中起的作用,对miRNA及其靶基因进行验证,最终发现了VSMC损伤修复的模型。


    研究思路

    研究结果

    1.发现问题——血小板诱导VSMC分化
    在最开始的实验中,作者将活化血小板(APs)和人主动脉血管平滑肌细胞VSMC共培养,预期的结果是血小板会诱导VSMC去分化。但是结果却出乎意料,经APs共培养的VSMC的分化标志物的蛋白表达明显高于静止血小板共培养(RPs)和无血小板共培养(Ctrl),同时VSMC去分化标志物同时显著降低(图1),表明活化的血小板反而诱导了VSMC的分化。
    这个结果与众所周知的血小板活化会促进VSMC去分化这一观念相反。那么在这个结果背后应该有其他的分子参与进来,作者首先想到了miRNA,血小板中的miRNA是比较理想的分子,因为它们可以催化调节许多蛋白质,确保VSMC回到分化的静止状态。因此开展了后续的研究。PS:miRNA还会调控靶基因导致抑制蛋白翻译,如果我们做实验发现mRNA和蛋白的结果相反时,也可以考虑下是否有miRNA在其中起作用哦~


    图1. VSMC的分化和去分化标志物的表达情况

    2.找到原因——活化的血小板将mirna转移到VSMC中以抑制VSMC的去分化
    作者通过体内和体外实验,发现在动脉损伤时活化的血小板被转移到VSMC的内部。内化的血小板必须包含有效的药物来启动从VSMC去分化到分化的转换,而血小板中有大量的miRNA。作者通过与活化血小板共培养的VSMCs的透射电镜成像,证明了miRNA从内化的活化血小板转移到VSMCs中。

    为了寻找参与VSMC去分化过程中起作用的血小板miRNA,作者对与血小板共培养(APs)或空白组 (control)的VSMC进行miRNA测序。通过miRNA测序找到许多差异表达的miRNA,在其中找到关键miRNA:miR-223,miR-143/145。

    为了进一步验证miRNA在其中的作用,作者使用前列环素(防止血小板活化)或RNase A(降解RNA)预处理血小板,结果发现会显著降低VSMCs中miR-223和miR-143/145的表达(图2C),而前列环素和RNase A的预处理会显著降低APs对VSMCs的促分化作用(图2D)。

    这些结果显示VSMCs通过吸收活化血小板,使血小板miRNA水平转移到VSMCs,从而使VSMC去分化的状态转化为VSMC分化。



    3.寻找miRNA的靶基因

    由于miRNA通过靶向mRNA起作用,因此作者通过生信分析和荧光素酶报告基因检测,发现了miR-143、miR-145和miR-223的靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ。
    为了进一步证明血小板miR-143、miR-145和miR-223确实对VSMC表型转换至关重要,作者进行了挽救实验。

    在正常葡萄糖水平和高糖条件下研究miR-143、miR-145和miR-223和其靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ的表达量变化情况。作者发现在共培养早期(6-12小时),血小板释放的PDGF促进VSMC增殖, miR-223在VSMCs中积累。随后(24 - 48小时), VSMCs利用miR-223抑制细胞增殖及靶基因PDGFRβ的表达 (图3)。
    综上所述,这些数据表明血小板释放的miRNA是VSMC转化的主要调控因子。



    图3.细胞增殖率、miR-223和PDGFRβ的表达情况

    4.验证靶向关系

    虽然上一步通过表达量的关系,作者推测出了miR-223和PDGFRβ的关系,但是还需要进一步进行验证。因此作者在受伤和未受伤的股动脉中进行了miR-223抑制试验。在未受伤的血管中,PDGFRβ的表达很低。在损伤后4周,相比于对照组,miR-223 被抑制的实验组中PDGFRβ的表达上调(图4)。这些结果表明, PDGFRβ的确是miR-223的靶基因。
    miR-143、miR-145同时存在于血小板和VSMC中,而miR-223特异性表达于造血系统(包括血小板)中,在VSMC没有显著表达。因此作者还进行了一项实验,证明在VSMCs共培养中内化的活化血小板的miR-223水平明显高于活化血小板衍生微粒。结合之前发现的内化血小板的大小和形态,这些研究表明了miR-223是从激活的全血小板转移到VSMC中,并促使了VSMC的表型转换。


    图4. 受伤股动脉的VSMCs 中PDGFRβ的表达情况

    5.在糖尿病患者中推测理论
    在糖尿病等病理条件下,血小板中的miRNA水平会发生改变,而作者研究观察到患糖尿病(DM)的人和小鼠的血小板中miR-223的表达降低(图5),因此作者对DM和WT小鼠进行研究,通过荧光原位杂交发现,在DM条件下,尽管血小板被内化到VSMCs中,但血小板中的mirna水平转移明显减少,并且导致它们的靶基因在体内的表达增加。

    这些结果与之前的体外研究结果一致,即血小板来源的miR-223水平转移到VSMC,通过下调PDGFRβ从而抑制VSMC的去分化。但DM的条件下, miR-223 的表达降低,PDGFRβ的表达增加,导致血管平滑肌细胞增殖和内膜的增生。


    图5.miR-223在健康受试者和DM患者、非DM小鼠和DM小鼠血小板中的表达

    6.模型——提出了正常和DM血小板中mirna转移到受损血管VSMCs的模型


    通过上述一系列的研究,作者提出了VSMC损伤修复机制的模型:在正常生理过程中,内皮屏障是完整的,血小板是静止的,与VSMC没有相互作用。当受到损伤时,内皮屏障受损,暴露内皮下层,导致血小板活化。

    除了血栓形成外,还释放出可启动伤口修复的药物,包括诱导VSMC脱分化和细胞增殖。激活的血小板随后被VSMC吸收,并释放miR-223以及其他如miR143/145,这些miRNA对VSMC脱分化起抑制作用,转而向VSMC分化。后续延迟反应会阻止VSMC的过度修复,从而减少内膜增生。但在miR-223减少的DM血小板中,VSMC会发生过度增殖导致内膜的过度增生。


    图.VSMC损伤修复模型

    小结

    作者首先从前期实验发现了与预期相反的结果中提出了假设:可能存在miRNA在其中起作用,随后找出可能起作用的miR-223,并对其验证;接着寻找miR-223的靶基因PDGFRβ,并验证了靶向关系,从而推测出VSMC损伤修复的模型。

    除了在正常水平下,作者还想到了糖尿病的情况下miRNA的表达会降低,从而推测出糖尿病情况下VSMC的损伤修复模型。在一步步的抽丝剥茧中将VSMC损伤修复的机制完整的展现出来,是一个非常值得借鉴的文章思路哦。

    本文作者:基迪奥半夏
                   

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    发表于 2019.3.6 10:36:51 | 显示全部楼层
    好厉害哦
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