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蛋白修饰系列第二期——如何进行蛋白修饰的研究

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    发表于 5 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式
    上期我们初步介绍了蛋白翻译后修饰(回顾戳这里☞),大家已经了解了什么是蛋白修饰以及有哪些蛋白修饰类型。那么接下来,我们可以深入了解下,如何进行蛋白修饰的研究。
    之前我们提到过,对于发生修饰和未发生修饰的蛋白,它们之间主要的差异其实是官能基团的区别,通过质谱的方法,可以帮助我们对修饰位点、修饰肽段进行定性定量的研究,从而深入到机制研究。那么今天我们就来详细介绍一下,蛋白修饰组学到底是怎么研究的。


    图1.蛋白修饰组学实验流程

    第一步:修饰肽段的富集

    通常发生修饰的蛋白含量都比较低,用常规的提取方法无法获得足够后续分析的修饰蛋白,因此需要先对样本中的修饰蛋白进行富集。
    以磷酸化蛋白为例,它的富集方法非常多,有金属氧化物亲和色谱法(TiO2 /Al2O3…)、固相金属亲和色谱法(IMAC)、预分离色谱法、化学衍生修饰法、免疫亲和富集法等等。但目前最主流的富集方法就是TiO2富集法,TiO2在酸性溶液中带正电荷,可以与磷酸化肽段产生静电作用,从而使磷酸化的肽段得到富集。
    不同的修饰模式的富集策略也有所不同,比如糖蛋白通常采用凝集素亲和的方法进行富集,而乙酰化主要抗体的进行富集等等。不管是哪种修饰类型,总之,第一步就是要把修饰的肽段进行富集,当我们富集到足够的修饰肽段之后,就可以拿去打质谱啦。

    第二步:质谱分析

    刚刚我们说过,修饰与未发生修饰的蛋白主要的区别在于官能基团的存在与否,对应的也会改变蛋白的分子量,而质谱可以帮助我们识别出这些发生分子量变化的蛋白。我们在鉴定的时候,会先通过一级质谱对肽段判断,通过分子量有没有增加或减少来判断是否发生修饰。
    当一级质谱确定有无修饰后,再通过二级质谱进一步判断是在哪个氨基酸上增加了分子量,从而获得修饰位点的信息。获得了这些信息之后,我们就可以对这些肽段进行生信分析。

    第三步:生信分析

    生信分析其实是和我们文章最相关的部分了,因为前期的步骤都是放在method部分介绍,而这一部分是要需要花心思进行详细解读的,那么我们一起来看下通过生信分析可以获得什么样的信息吧。

    1质控信息

    当我们看到检测结果的时候,是不知道效果好不好,因此需要对结果进行质控。通常质控主要看质谱图数是否理想、谱图质量是否合格、质谱精度是否稳定等等,以证明实验做的不错,可以放心的进行后续分析。通常这一部分的结果可以放进毕业论文或者文章的附图中,不用在正文中过多介绍。


    图2.质谱检测质量精度分布图

    2总体情况展示

    当我们知道质谱结果没有问题之后,就可以对结果开始分析了。分析的第一步,就是要对总体修饰情况进行统计,即发现了多少个修饰蛋白,多少个修饰肽段,以及多少个修饰位点。
    另外由于磷酸化会发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上,我们还可以统计发生在这3种氨基酸上的磷酸化数量,不过由于它们的比例已经被研究的非常透彻(1800:200:1),通常不会有太大的差别。通过对这些修饰信息的统计,可以帮助我们了解样本的修饰情况,也为后一步的差异分析打下基础。
    除了修饰情况,我们还可以用PCA或PLS-DA图展示样本的情况,方便我们判断样本的重复性和组间的差异程度(和常规的转录组、蛋白组差别不大),通常放在文章中展示样本的重复性比较好,实验没什么问题,并且组间具有差异,可以往下进行分析。

    图3.磷酸化位点和磷酸化蛋白的数量(左)和PCA图(右)

    3差异蛋白情况

    整体分析完之后,接着就是进行差异的修饰蛋白分析,差异分析可以说是文章非常重要的一环,通过对蛋白进行差异分析,我们可以得到不同比较组之间的差异情况,而这些差异的蛋白,可能就是导致不同样本之间表型差异的主要原因。在这一部分我们通常可以利用火山图或热图展示这些差异蛋白。

    由于这些蛋白可能与表型差异息息相关,因此,我们常常会针对这些蛋白进行GO和KO富集分析,从而了解这些差异蛋白所富集的功能,帮助我们找出与表型差异有关的通路,推测出可能存在的调控机制。这部分的分析同样和常规的转录组、蛋白组差别不大,针对富集结果,挑选出与目标相关的通路、蛋白深入讨论就可以了。


    图4.聚类热图(左)富集分析气泡图(右)

    4个性化分析

    除了上诉的分析,在蛋白修饰中,还有一个非常重要的分析点——motif分析。蛋白质的序列 motif在蛋白中普遍存在,可以被用于蛋白质功能的预测工具。而蛋白修饰过程中通常需要相应的酶识别特定的motif,所以对修饰蛋白的motif进行研究,可以帮助我们了解修饰蛋白可能参与的具体生物学功能。

    此外,我们还可以对修饰蛋白进行互作蛋白的string分析,通过蛋白质网络图了解修饰蛋白可能存在相互作用的蛋白,从而更深入的了解这些修饰蛋白的功能。另外,蛋白所处的位置不同,功能也会不一样,因此有些文章会对这些修饰蛋白进行亚细胞定位(比如用WoLF PSORT预测),推测修饰蛋白所处的位置。

    在多结构域蛋白质中,不同的结构域常常与不同的功能相联系,因此也可以用InterProScan预测蛋白的结构域。针对蛋白的个性化分析有各种各样,我们也可以根据不同的需求进行不同的分析。

    Motif分析结果


    String分析结果

    其实,现在的蛋白修饰文章套路和早期的转录组文章类似,将测序获得的结果进行分析和总结,获得一定的结论,就可以进行文章发表了。那么下一期,我们就用实际案例为大家介绍,蛋白修饰组的应用,我们下期见~


    本文作者:基迪奥半夏

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    string的图依然无法接受
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