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[其他] 表观遗传系列之三种研究DNA甲基化测序技术介绍

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    发表于 2018.11.15 09:35:09 | 显示全部楼层 |阅读模式
    在表观遗传中,DNA甲基化修饰具有非常重要的地位,并且甲基化修饰方式多种多样,其中最常见、研究最广泛的是胞嘧啶杂环5号位的甲基化修饰,又称作5-甲基胞嘧啶(5mC)。
    DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。异常的DNA甲基化会导致发育异常、肿瘤等疾病的发生。因此,DNA甲基化的研究对于深入理解基因表达、个体发育以及疾病的发生、发展机制都具有重要意义。

    之前基迪奥公众号和在线课堂已经对DNA甲基化的形成及调控机制进行了详细地介绍。

    往期DNA甲基化文章回顾:
    所有物种都存在DNA甲基化吗?
    DNA甲基化如何被写入和擦除?
    DNA甲基化如何被写入和擦除?(下篇)




    在线课堂--表观遗传系列课程:
    DNA甲基化的形成机制和检测方法
    逆境胁迫应答、遗传与DNA甲基化调控

    今天主要介绍三种常见研究DNA甲基化的高通量测序技术:全基因组甲基化测序(WGBS)、简化甲基化测序(RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)。三种技术在检测范围、检测精度及适用范围各不相同,且都有各自的优势,可结合具体研究情况进行选择。

    WGBS

    重亚硫酸盐(Bisulfite)处理能够将未甲基化修饰的C碱基转化为U,而甲基化修饰C碱基将保持不变,因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。
    WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing,全基因组甲基化测序)将Bisulfite处理与高通量测序技术相结合,能够绘制全基因组高分辨率DNA甲基化图谱,可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。

    WGBS具有单个碱基分辨率,研究的是全基因组甲基化,测序费用相对来说比较高,在预算有限但刚好样本量或基因组较小的情况下可以考虑WGBS(当然,预算够够的时候,什么都不用考虑直接用)。


    图1 WGBS技术路线图

    RRBS

    RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing,简化甲基化测序)是利用限制性内切酶MspⅠ酶对基因组进行酶切,富集CpG片段,再进行Bisulfite测序,从而对富集片段的甲基化展开分析。

    RRBS是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法,可以极大幅度地提高CpG区域的测序深度,还能通过酶切位点过滤部分降解片段对结果的影响。并且由于RRBS主要关注CpG富集区域的甲基化,能够避免过多的数据浪费,可以更有针对性地研究覆盖区域的甲基化状态,在大规模的临床样本的研究中具有广泛的应用前景。


    图2 RRBS技术路线图

    MeDIP-Seq

    MeDIP-Seq (Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,甲基化DNA免疫共沉淀测序)是一种基于富集方法研究DNA甲基化的测序技术,针对不同甲基化类型选择不同抗体。

    目前主要是利用5mC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,在高CpG密度、高DNA甲基化水平区域具有很好的抗体亲合性,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

    MeDIP-Seq的覆盖范围主要是高CpG密度、高DNA甲基化水平区域,和RRBS相似,适用于大样本量的甲基化研究。与WGBS和RRBS不同的是,MeDIP-Seq检测的甲基化图谱不能精确到单个碱基位点。


    图3  MeDIP-Seq生物信息分析流程

    样本要求
    样本类型:真核生物,具有参考基因组和较为完整的注释;推荐起始量:新鲜动物组织干重≥1g,新鲜植物组织干重≥2g,新鲜培养细胞数量≥3x107个,全血≥2mL;样品质量:DNA浓度≥50 ng/μl,总量≥5μg,无 RNA污染,条带清晰,无降解。

    另附上DNA甲基化分别在人、动物和植物中的应用案例解析。
    应用案例一  DNMT3甲基转移酶在小鼠胚胎发育过程中的研究[1]
    在胚胎发育早期,精子和卵子间,存在差异甲基化区域;差异甲基化的区域,囊胚期会被调整到低甲基化状态;在母源遗传的部分,还依然会保持一定的部分甲基化状态。通过研究小鼠在胚胎发育早期3.5~8.5d至成年甲基化变化过程,讨论DNMT3A和DNMT3B在de novo甲基化中的作用。

    研究发现,小鼠胚胎发育过程中,4.5d~5.5d甲基化速率最快,后期变化很缓慢; GpG岛的甲基化进展要慢于基因组其他区域,8.5d启动子区和外显子区甲基化率大于50%的基因分别与配子功能和发育过程相关的重要基因(参与转录因子的调控、胚胎形态发生)有关。

    在早期外胚层,全局甲基化水平与DNMT3A/B的上调正相关;DNMT3A/B的作用是相似的,但DNMT3B在常染色和X染色体的CpG岛的甲基化起到主导作用。DNMT3B建立了印记位点,这些标记区分了生殖细胞和体细胞的甲基化印记。


    图4 发育过程GpG岛和全基因组甲基化速率

    应用案例二  Ph+慢性髓系白血病发展过程中DNA甲基化变化[2]
    甲基化在许多恶性疾病的发病机理中有重要的生物学意义。慢性粒细胞白血病(CML)是一种源自干细胞的恶性肿瘤,可分为慢性期(CP),加速期(AP)和急变期(BC)。表观遗传变化,特别DNA甲基化在CML发展中的功能至今尚未详细研究。研究利用RRBS分析CP、AP和BC CML患者及对照个体的CpG位点甲基化差异,并利用RNA-seq研究这些样品中的基因表达情况。
    RRBS研究结果显示,与对照组相比,CML甲基化CpG位点更多;CP-CML组仅鉴定了约600个差异甲基化CpG位点,BC-CML组则发现约6500个差异甲基化CpG位点。大多数受影响的CpG位点,甲基化水平增加。发展到AP-CML/ BC-CML的CP-CML组中,鉴定了897个在发展时甲基化,但在诊断时未甲基化的基因。
    RNA-seq结果显示,与CP-CML组相比,BC-CML组中这些基因很多出现表达下调,其中一些是已知的肿瘤抑制基因或细胞增殖调节因子,而使用表观遗传药物可以使基因重新表达。


    图5  AML患者与对照差异甲基化CpG位点分析
    应用案例三 柳枝稷甲基化调控研究[3]
    柳枝稷可用于提炼乙醇,在绿色生物燃料领域有重要价值。本研究进行BS、链特异性文库测序和小RNA文库测序,对柳枝稷DNA甲基化及其与编码、非编码RNA的调控关系进行了全面分析,为生物燃料作物的表观遗传研究提供了参考。
    BS获得的 1,480,569个DMRs(Differential methylation regions),其中大部分CG型和CHG型的DMRs在叶中高甲基化,而几乎所有的CHH型DMRs在叶中低甲基化。
    对每种甲基化类型分别进行甲基化水平与表达量比较和spearman相关性分析(图1),发现CG和CHG型启动子区的甲基化与基因表达负相关,CG型gene body区的甲基化与基因表达正相关,而CHG和CHH型呈负相关。


    图6 CG型甲基化与基因表达量比较(左)和spearman相关性(右)

    文章详细解读请戳:基迪奥客户文章 - 柳枝稷表观遗传研究
    表观遗传系列文章:表观遗传你了解多少?

    参考文献
    [1]Auclair G, Guibert S, Bender A, etal. Ontogeny of CpG island methylation and specificity of DNMT3methyltransferases during embryonic development in the mouse[J]. Genomebiology, 2014, 15(12): 545.[2]Heller G, Topakian T, Altenberger C,et al. Next-generation sequencing identifies major DNA methylation changesduring progression of Ph+ chronic myeloid leukemia[J]. Leukemia, 2016,30(9):1861-1868.[3]Yan H, Bombarely A, Xu B, et al. siRNAsregulate DNA methylation and interfere with gene and lncRNA expression in theheterozygous polyploid switchgrass[J]. Biotechnology for Biofuels, 2018, 11(1):208.
      本文作者:基迪奥李白

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