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代谢组学入门十问!

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    发表于 2017.5.27 10:19:29 | 显示全部楼层 |阅读模式

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    之前我们说过,在基因组、转录组和蛋白质组研究渐趋成熟之后,代谢组学研究将是后基因组时代的重要研究趋势之一。(戳这里查看代谢组学介绍~)今天小瑶就跟大家分享一下,代谢组学FAQ,或许有你的关注点哦。

    问:代谢组能够检测到的代谢物含量最低是多少?
    答:不同检测平台的灵敏度不一样,LC-MS灵敏度最高,可达到fM级。另外,相同含量的不同物质,由于自身化学性质不同,质谱的离子化效率、信号响应强度会差异很大。物质的检测灵敏度跟自身的化学性质有关,化学性质的影响主要表现在离子化效率和质谱碎裂行为两方面。因此,相同含量的不同物质,可能一个能检测出来,另一个检测不出来。

    问:质谱时如何选择正离子模式还是负离子模式?
    答:选择正负离子模式主要是根据化合物的性质,也就是看结构;而流动相环境影响分析的灵敏度。有的物质容易带正电荷,有的物质容易带负电荷。比如碱性化合物易带正电荷,加合质子或其他正电荷离子;酸性化合物易带负电荷,失去质子或加合其他负电荷离子。比如含羧基、磺酸基的物质,一般肯定可以使用负离子模式,因为在一般情况下可以电离为R-COO-和R-SO3-;在酸性的流动相中,如pH3以下,羧酸根可能就不好电离成负离子了,这时负离子监测的灵敏度下降,而磺酸根酸性较大,仍然可以电离。目前一般是正离子模式应用更多,一方面由于色谱柱的性质流动相一般偏向酸性(pH2-8);另一方面,普遍采用的ESI离子源是一种超软电离的离子源,在酸性条件下大部分极性较大的化合物都可以加和氢离子,形成正电离子,如没有氮的黄酮类、脂类、糖类等。而且负离子模式相应一般比正离子模式小一个数量级。因此,在实际操作时需要根据实际情况条件来选择,也可以两种模式都适用。

    问:基峰图(BPC)和总离子流图(TIC)有什么区别?
    答:基峰是在质谱图中,指定质荷比范围内强度最大的离子峰。基峰图(Base  Peak  Chromatogram,BPC):是将每个时间点质谱图中最强的离子的强度连续描绘得到的图谱。总离子流图(TIC):在选定的质量范围内,所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图。TIC和BPC都是对于样品整体信息的反映,一般情况下BPC图比TIC图要漂亮,所以文章里面很多时候会用到BPC图。但是有的学者认为BPC图不是样品真实的反映,所以不接受BPC,只接受TIC。

    问:差异代谢物筛选一般用什么标准?
    答:一般同时采用多元变量统计模型的VIP值和单变量统计T检测的P值来筛选差异代谢物。单变量统计分析方法如t检验、方差分析等更加注重代谢物水平的独立变化,多元变量统计分析更加注重代谢物之间的关系以及它们在生物过程中的促进/拮抗关系。同时考量两类统计分析方法的结果,有助于我们从不同角度观察数据,得出结论,也可以帮助我们避免只使用一类统计分析方法带来的假阳性错误或模型过拟合。筛选的阈值一般是VIP>1和P<0.05。如果得到的差异代谢物很多,可以再加上差异倍数这个筛选条件。

    问:发现没有差异代谢物,该怎么办?
    答:如果利用常用的阈值(VIP>1和P<0.05)筛选却没有找到差异代谢物,可以试试把阈值放宽些,VIP>0.8。如果是用OPLS-DA筛不出差异代谢物,可以用PLS-DA试试。如果还是没有筛选出差异代谢物,那么还可以对检测到的物质进行KEGG pathway分析,对代谢物参与的代谢通路进行研究,也可以得知代谢物主要参与的通路,结合研究目的进行讨论。

    问:为什么在实验中物质A的含量明显大于物质B,然而在代谢组数据中物质B的信号强度明显大于物质A的信号强度?
    答:由于不同物质具有不同的分子结构和性质基团,故不同物质在质谱的离子化效率、信号响应强度等参数都不尽相同,最后的结果是不同物质的质谱检测效率差别很大。因此比较代谢组学的定量结果,仅适用于同一物质在不同状态(实验/对照)间的比较,而不是不同物质在同一实验状态下的比较。

    问:PLS-DA和OPLS-DA模型有什么区别?
    答:OPLS-DA比PLS-DA多了一个正交换算,把与模型分类不相干的信号过滤掉,因此OPLS-DA解释能力更强。比如组间差异比较小,组内差异比较大时,用PLS-DA的VIP筛选出的可能是组内差异变量,容易误导,而OPLS-DA则优于PLS-DA,可更准确地筛选出组间差异。

    问:PCA和OPLS-DA模型中,有些样本偏离了95%置信区间,这种数据需要剔除吗?
    答:不建议剔除。因为我们设置生物学重复本来就是为了减少误差,出现一两个样本偏离属于正常情况,而且也不会影响后续的数据分析,所有无需剔除。

    问:PLS模型交叉验证得到的Q2值小于0.5就说明该模型不能用吗?
    答:一般认为Q2值越接近1,模型的预测性越好,但没有那么明确的要求一定要Q2>0.5,若Q2<0.5,说明模型的预测效果没那么好,可信度不那么高,也是可以用的。Q2值至少用来作为判断参考的,并不是绝对的。

    问:找到差异代谢物之后,如何验证这个代谢物的功能?
    答:首先要进行定性定量验证。主要是采用三重四级杆进行靶向验证,获得绝对定量信息。然后通过前期的代谢通路分析,我们知道这个差异代谢物属于哪条调控通路,那么可以对该通路上的分子进行功能验证。另外,还可以增加其他组学的数据,如转录组、蛋白组,进行相互补充。



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    谢谢!
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